Гетеротипические Трехмерные

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании трехмерных типичных моделей ранних стадий развития рака яичников. Сначала создаются иммортализованные клеточные линии H turt, полученные из первичных нормальных эпителиальных и фибробластных тканей яичника. Затем, для воссоздания архитектуры in vivo и сложных межклеточных взаимодействий, характерных для яичника, линии эпителиальных и стромальных клеток культивируют совместно в трехмерных моделях сфероидов S. Далее следует провести фиксацию и окрашивание культур органоидов, а также проанализировать экспрессию специфических маркеров для изучения молекулярных особенностей взаимодействий между стромой и эпителием.

Полученные результаты показывают, как изменения в стромальном компоненте 3D-типических моделей могут влиять на фенотип совместно культивируемых эпителиальных клеток. Трехмерные типические модели могут помочь в решении ключевых вопросов в области исследования рака яичников, таких как изучение происхождения этого заболевания и выяснение роли стромального микроокружения в инициации и развитии опухоли. По сравнению с другими методами 3D-культивирования, применение данных методов распространяется на диагностику и терапию заболеваний.

Данный метод может быть применен для более широкого диапазона объемов клеточных культур и последующих приложений. Например, гомотипические и типовые 3D-культуры могут быть использованы для тестирования лекарственных препаратов in vitro. Этот подход также может быть применен к другим модельным системам, например, при изучении других типов солидных опухолей или доброкачественных заболеваний.

Перенесите свежую ткань яичника в лабораторию клеточных культур в среде для роста иммортализованных нормальных фибробластов яичника, дополненной дополнительными антибиотиками и антимикотиками. Промойте образец трижды пятью миллилитрами PBS для удаления эпителиальных клеток, которые остаются слабо прикрепленными к ткани. Затем перенесите образец вместе с PBS в чистую культуральную чашку P 100. Используя стерильные инструменты, перенесите ткань во вторую сухую чистую культуральную чашку P 100.

Разрежьте ткань на фрагменты по 0,5 квадратного сантиметра и перенесите каждый фрагмент в отдельную чашку P 100. Продолжайте измельчать ткань до достижения размера фрагментов менее одного квадратного миллиметра. Затем добавьте 20 миллилитров среды INOF GM и культивируйте. Контролируйте рост клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Убедитесь, что клетки прикрепились к планшету в течение 24 часов. Контролируйте рост клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. Обычно клетки прикрепляются к планшету в течение 24 часов. Через неделю удалите все неприкрепившиеся ткани с помощью аспирации, обновите среду, после чего проводите замену среды дважды в неделю в течение одного-трех недель, пока размер клеточных колоний не достигнет примерно 500 microns.

Изолируйте клоны с помощью трипсина и покрытых клонирующих дисков. Для подтверждения того, что все клетки являются фибробластами, высейте образец клеточной линии на стеклянные покровные стекла и проведите иммунофлуоресцентное окрашивание на маркер фибробластов, эпителиальный маркер и маркер эндотелиальных клеток.

За один день до ретровирусной трансдукции пассажа H Turt разделите изоляты нормальных фибробластов яичника из одной чашки P 100 на три чашки P 100. Готовый вирусный супернатант можно приобрести или получить самостоятельно, используя стандартные протоколы ко-трансфекции клеток HEC 2 9 3 T. Для приготовления раствора поли-HEMA отберите навеску поли-HEMA массой 1,5 грамм и поместите ее в стерильный флакон.

Добавьте 95 мл абсолютного этанола для молекулярной биологии и пять мл дистиллированной воды для культур клеток. Поместите раствор поли-HEMA в водяную баню при температуре 65 °C до полного растворения. Покройте чашки для культивирования тканей свежеприготовленным раствором поли-HEMA.

Высушите чашки для культивирования клеток на воздухе внутри ламинарного шкафа. Для обеспечения равномерного покрытия чашек большего размера или флаконов можно использовать осторожное покачивание на платформе-качалке. Если раствор поли-L-лизина высохнет слишком быстро, поверхность не будет гладкой.

При необходимости проведите предварительную обработку фибробластов перед созданием 3D-культуры; например, для индукции старения обработайте клетки sublethal дозами перекиси водорода. Восстановите и нарастите культуры INOF и эпителиальных клеток in vitro, чтобы подготовить достаточное количество клеток для создания 3D-гетеротопических стероидов. После пятиминутной промывки в PBS добавьте 15 миллилитров среды в планшет с poly hema.

Тем временем добавьте трипсин к иммортализованным нормальным фибробластам яичника, чтобы отделить их от культурального чашки. Через три-пять минут нейтрализуйте трипсин равным объемом культуральной среды и соберите клетки путем центрифугирования. Ресуспендируйте клеточный осадок в пяти миллилитрах среды и тщательно перемешайте, используя дозирование пипеткой или осторожное вортексирование.

Затем используйте пробу объемом 10 µL для подсчета жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. Теперь добавьте 4 млн клеток INOF в среду, уже разлитую по планшету с поли-HEMA покрытием. Доведите объем культуральной среды до 20 mL и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2.

Контролируйте агрегацию клеток в многоклеточные сфероиды с помощью фазово-контрастной микроскопии, чтобы обновлять питательную среду в культурах сфероидов каждые два-три дня. Установите планшеты под наклоном, опираясь на пипетку. Дайте сфероидам осесть и осторожно удалите около 16 миллилитров отработанной среды с помощью пятимиллилитровой пипетки.

На седьмой день добавьте в культуру 16 milliliters свежей среды и верните её в инкубатор. Создайте гетеротипические культуры, добавив эпителиальные клетки к фибробластам. Сначала, после подсчета клеток, приготовьте суспензии эпителиальных клеток яичников с помощью трипсина, как было описано ранее.

Промойте один раз в среде INOF GM, чтобы предотвратить перенос факторов роста из среды для культивирования эпителиальных клеток. После обновления среды в культурах OID фибробластов добавьте эпителиальные клетки в соотношении четырех фибробластов к одной эпителиальной клетке. Гетеротопические OID в среде INOF GM пересаживают в типичные культуры каждые два-три дня в течение дополнительных 14 дней.

Для иммуногистохимического анализа зафиксируйте PHE нейтральным buffered формалином, осадите PHE центрифугированием и замените формалин 70% ethanol. Далее проведите заливку в парафин, используя стандартные протоколы для тканей человека. Срезы стероидов, залитых в парафин, можно подвергнуть окрашиванию гематоксилином и эозином (h and e) или специфическими молекулярными маркерами с помощью иммуногистохимии.

В качестве альтернативы промойте стероиды в PBS и зафиксируйте в 4% параформальдегиде. Затем заключите образцы в среду OCT и подвергните мгновенной заморозке для изготовления срезов на криостате и иммунофлуоресцентного окрашивания для последующего анализа методом проточной цитометрии. Промойте стероиды в PBS и диссоциируйте путем переваривания трипсином или Accutane при 37 °C.

Полную диссоциацию стероидов в одноклеточную суспензию можно ускорить путем многократного пипетирования раствора с помощью наконечника дозатора объемом 1 мл. Будьте осторожны, чтобы не повредить клетки механически. Нейтрализуйте реакцию равным объемом культуральной среды и удалите скопления клеток, пропустив суспензию через клеточный фильтр с размером пор от 40 до 70 мкм. Затем осадите клетки центрифугированием, промойте их раствором PBS, подсчитайте количество клеток, ресуспендируйте необходимое число клеток в буфере FACS и проведите окрашивание согласно инструкциям производителя. В нашей лаборатории мы использовали частично трансформированные эпителиальные клетки яичников и культивировали их совместно с нормальными и сенесцентными фибробластами яичников для имитации развития рака яичников на ранней стадии.

При иммунофлуоресцентном окрашивании яичника в пременопаузе бессмертные нормальные фибробласты яичника человека демонстрируют, что как первичные нормальные фибробласты яичника, так и бессмертные нормальные фибробласты яичника экспрессируют специфический белок фибробластов, однако они не экспрессируют цитокератин семь и экспрессируют ментин. Нормальные фибробласты яичника, культивируемые самостоятельно в 3D-форме PHE, имеют веретенообразную морфологию и обильный внеклеточный матрикс. В данной работе нормальные фибробласты яичника подвергали воздействию перекиси водорода для индуцирования старения в течение семи дней, после чего их культивировали совместно с частично трансформированными эпителиальными клетками яичника в течение 14 дней.

Для различения двух типов клеток полученные сфероиды были подвергнуты иммуногистохимическому окрашиванию на Ki-67 в качестве маркера пролиферации и на панцитокератин в качестве эпителиального маркера. Количественный анализ данных позволяет предположить, что стареющее микроокружение способствует развитию неопластических признаков в частично трансформированных эпителиальных клетках, тогда как нормальное микроокружение подавляет неопластическую прогрессию; при этом восстанавливаются гистологические признаки нормальных и злокачественных клеток, которые не обнаруживаются при культивировании клеток в виде монослоя. Например, при переходе клеток в сфероидную культуру гистологические признаки светлоклеточного рака яичника могут быть обнаружены в 3D-культурах клеточных линий светлоклеточного рака яичника, но не в монослойных культурах тех же клеток.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать трехмерные типические культуры для изучения взаимодействий между эпителиальными и стромальными клетками в период раннего онкогенеза. При создании 3D-культуры важно корректировать количество клеток в зависимости от целей последующего анализа, учитывая возможную потерю материала в процессе обработки.

После освоения данной процедуры подготовка 3D-культур занимает один час. Для анализа глобальных изменений экспрессии генов, которые происходят в типичных 3D-культурах, но не обнаруживаются в условиях монослойного культивирования, можно использовать другие методы, такие как проточная цитометя в сочетании с микрочиповым профилированием экспрессии генов. Это позволит детально изучить двунаправленные сигнальные пути, которые активируются специфически в условиях микроокружения 3D-культуры.