MAME Модели 4D Онлайн-клеточного изображения опухоли: микроокружение взаимодействия, что воздействие злокачественной прогрессии

Общая цель данной процедуры заключается в создании 3D-моделей совместного культивирования, называемых инженерией архитектуры и микроокружения молочной железы (MAM), для использования при визуализации взаимодействий клеток в режиме реального времени. Это достигается путем предварительного покрытия покровных стекол коллагеном I типа, гасящим флуоресценцию фибробластов (DQ-коллаген I). Матрикс из коллагена I.

Затем следует DQ-коллаген. На поверхность затвердевшего слоя DQ-коллагена I наносится реконструированный матрикс базальной мембраны, представляющий собой матрикс коллагена I с внедренными фибробластами. На третьем этапе на покровные стекла наносится суспензия эпителиальных или опухолевых клеток, что позволяет клеткам прикрепиться к DQ-коллагену и реконструированному матриксу базальной мембраны, после чего добавляется среда.

Наконец, для проведения 4D-визуализации используется конфокальная микроскопия, которая позволяет анализировать изображения живых маммоидных кокультур в трех пространственных измерениях и во времени. В конечном итоге 4D-визуализация обеспечивает возможность наблюдения и анализа динамического взаимодействия между клетками опухоли молочной железы и другими клетками опухолевого микроокружения, которые могут влиять на прогрессирование в сторону инвазивного фенотипа. Основным преимуществом этого метода перед существующими подходами, такими как прижизненная визуализация (intra vital imaging), является то, что в нашей модели наблюдаются взаимодействия между клетками одного вида — человеческими опухолевыми клетками и ассоциированными с опухолью человеческими клетками, а не, например, между человеческими опухолевыми клетками и стромальными клетками мыши.

Как правило, люди, впервые осваивающие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку процесс сборки основных стержневых культур сначала требует визуального ознакомления, а затем — определенного уровня навыков и практики для достижения успеха. Начните с того, что положите одну стерилизованную спиртом прямоугольную пластиковую крышку. Вставьте ее в 35-миллиметровую чашку для культивирования или используйте чашку mu IBI tree размером 35 миллиметров.

Затем смешайте необходимое количество фибробластов с DQ-коллагеном. Далее, используя микропипетку на 100 µL, осторожно нанесите и распределите 70 µL смеси фибробластов с DQ-коллагеном (один матрикс из одного коллагена) по всей поверхности покровного стекла и поместите чашку с культурой в увлажненный инкубатор при 37 °C без подачи углекислого газа на 30 минут. После затвердевания матриксов дайте им уравновеситься в течение 10 минут в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.

Затем поместите чашку под вытяжной шкаф до достижения комнатной температуры. Нанесите 60 µL DQ-коллагена, четыре реконструированных матрикса базальной мембраны поверх затвердевшего DQ-коллагена, один матрикс коллагена I с имплантированными фибробластами. Затем с помощью наконечника пипетки осторожно и равномерно распределите DQ-коллаген, четыре реконструированных матрикса базальной мембраны, стараясь не повредить фибробласты в матриксе DQ-коллагена I и коллагена I.

Затем перенесите чашку и покровное стекло в инкубатор при 37 °C с 5% CO2 на 10 минут; пока матрикс реконструированной базовой мембраны DQ collagen IV затвердевает, проведите трипсинизацию клеток и подсчитайте количество клеток для совместного культивирования. Теперь нанесите 50 µL клеточной суспензии на покрытое покровное стекло и поместите чашку в инкубатор при 37 °C с 5% CO2 на 40–60 минут, чтобы клетки прикрепились к матриксу реконструированной базовой мембраны DQ collagen IV. После прикрепления клеток к матриксу добавьте в чашку диаметром 35 мм 2 мл культуральной среды, содержащей 2% реконструированной базовой мембраны.

Затем, после промывки раствором PBS, инкубируйте кокультуры с 5 µM CellTracker Orange в среде MEGM в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение 45 минут. По завершении инкубации снова промойте кокультуры раствором PBS и инкубируйте их в предварительно нагретой среде MEGM в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Выполните визуализацию живых кокультур при малом увеличении (например, 10x с использованием иммерсионного объектива с погружением в воду) на конфокальном микроскопе, регистрируя оптические срезы с интервалом 10 мкм по всей глубине структур.

Используйте оптические срезы для реконструкции изображений в 3D с помощью программного обеспечения Velocity или аналогичной программы. Создайте видеоролики 3D-реконструкций, чтобы можно было визуализировать структуры, межклеточные взаимодействия и взаимодействия с окружающей матрицей. На данной репрезентативной схематической диаграмме совместного культивирования чашка с IBI была сначала покрыта коллагеном, одна содержала DQ-коллаген, в другую были добавлены фибробласты, обозначенные здесь пурпурным цветом.

Затем был добавлен второй слой реконструированной базальной мембраны, содержащий DQ коллаген четыре. Далее поверх были высеяны опухолевые клетки, отмеченные красным, и 2% реконструированной базальной мембраны. В культуре.

Среда, обозначенная точками кремового цвета, обновлялась при каждой замене среды. Флуоресцентные продукты расщепления DQ-коллагена I и IV показаны зеленым цветом. В течение 23 дней в данной репрезентативной совместной культуре MCF 10 DCIS и WS 12 TI наблюдалась пролиферация клеток (показана красным цветом здесь и на последующих рисунках), а также деградация DQ-коллагена IV и I (показана зеленым цветом здесь и на последующих рисунках) и коллагеновых матриксов, о чем свидетельствует уменьшение объема совместных культур.

Эти же живые кокультуры наблюдали в течение 23 дней, фиксируя изображения с помощью конфокальной микроскопии на 3-й, 16-й и 23-й дни кокультивирования. Взаимодействия в кокультурах Mame динамичны и могут меняться со временем. Например, как видно на этой 3D-модели кокультуры клеток Mame на третий день, на данном этапе клетки только начинают пролиферировать в матриксах и остаются достаточно стабильными, о чем свидетельствует отсутствие зеленой флуоресценции.

Однако к 16-му дню, по мере продолжения пролиферации клеток, они также начали разрушать структуру матрикса, что наблюдается здесь по продуктам расщепления DQ коллагена одного и четвертого типов, окрашенным в зеленый цвет; активный распад матрикса клетками проявляется в виде совместной флуоресценции матрикса и клеток, что видно в желтом цвете. К 23-му дню быстро пролиферирующие клетки разрушили почти половину матрикса по сравнению с 3-м днем, когда объем совместной культуры составлял 110 000 µm³. В период с 16-го по 23-й день объем сократился до 46 250 µm³.

В кокультуре 16 наблюдается протеолиз DQ-коллагена 4 на поверхности клеток DCIS (отмечены красным), а также диффузный протеолиз DQ-коллагена 1 в областях рядом с фибробластами (отмечены белым). Дифференциальное окрашивание, использованное в данной кокультуре, также позволяет наблюдать за различными паттернами миграции и пролиферации двух типов клеток после их развития. Этот метод открыл исследователям в области рака молочной железы путь к изучению влияния макроокружения опухоли на прогрессирование рака, обеспечивая визуализацию живых клеток и динамических взаимодействий между раковыми клетками и окружающими клетками стромы.