Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

Общая цель эксперимента, продемонстрированного в данном видео, заключается в том, чтобы оценить, играет ли антимикробный пептид лизин роль в смягчении вызванного декстрансульфатом колита у мышей. Это достигается путем инъекции костного мозга от мышей дикого типа облученным мышам дикого типа и нокаутным мышам, а также костного мозга от нокаутных мышей — облученным мышам дикого типа. Пересаженный костный мозг обеспечит генерацию новых клеток крови генотипа донора в организме реципиента.

Затем, через четыре недели, мышам-реципиентам вводят декстрансульфат для индукции колита. Успешность трансплантации подтверждают с помощью проточной цитометрии, а повреждение тканей толстой кишки оценивают гистологически. Полученные результаты показывают, что при трансплантации костного мозга мышей дикого типа мышам с нокаутом наблюдается облегчение симптомов колита.

Напротив, колит обостряется при трансплантации костного мозга нокаутных мышей мышам дикого типа. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы при определении экспрессии генов в клетках, производных из костного мозга, или в клетках не из костного мозга при воспалении или инфекции. Для проведения данного эксперимента рекомендуются мыши C 57BL/6 дикого типа и нокаутные мыши, чтобы обеспечить возможность отслеживания мышей дикого типа и нокаутных мышей.

Донорские клетки после трансплантации костного мозга. Для представления мышей дикого типа используйте мышей CD 45.1, а для нокаутных мышей — CD 45.2. На приведенной схеме описана схема эксперимента: для каждой группы назначается пять мышей-доноров и 10 мышей-реципиентов.

Для групп A и B костный мозг будет пересажен от мышей дикого типа мышам с нокаутом. Колит будет индуцирован в группе A, но не в группе B. Для групп C и D костный мозг будет пересажен от мышей с нокаутом мышам дикого типа, при этом колит будет индуцирован только в группе C. Для групп E и F пересадка будет осуществлена от дикого типа к дикому типу, а для групп G и H — от нокаута к нокауту. Чтобы подготовить донорский костный мозг для переноса облученным мышам, начните с извлечения костного мозга из костей послезабитых мышей в боксе биологической безопасности.

Используйте стерильные инструменты для диссекции, чтобы освободить плечевую, бедренную, большеберцовую и малоберцовую кости от прикрепленных мышц и связок, и перенесите их в чашку Петри. Срежьте оба конца костей, чтобы обнажить красный костный мозг. Затем захватите одну из костей пинцетом.

Вымойте красный костный мозг холодным PBS в другую чашку Петри, используя шприц объемом 3 мл и иглы 25-го калибра. Затем промойте кость с другого конца, чтобы получить больше клеток костного мозга. Повторите этот процесс для каждой кости.

Объедините костный мозг мышей дикого типа и нокаутных мышей раздельно. Используйте шприц объемом 6 мл с иглой 18 G длиной 1/2 дюйма, чтобы измельчить столбики красного костного мозга путем многократной аспирации и выталкивания. Затем с помощью серологической пипетки перенесите собранный костный мозг в коническую пробирку объемом 50 мл.

После переноса всего костного мозга центрифугируйте пробу при 740 G в течение пяти минут при температуре four degrees Celsius. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок, перемешивая на вортексе от пяти до 10 секунд. Добавьте к осадку пять миллилитров буфера для лизиса XRBC на одну мышь-донора, снова перемешайте на вортексе в течение пяти секунд и инкубируйте ровно три минуты при комнатной температуре.

Через три минуты добавьте по 20 мл холодного PBS в каждую пробирку и перемешайте путем инверсии, чтобы остановить лизис. Затем профильтруйте содержимое через клеточный фильтр с размером пор 40 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте исходную пробирку 5 мл PBS и перенесите раствор через клеточный фильтр.

Продолжайте собирать фильтрат в коническую пробирку. Затем доведите объем до 50 milliliters с помощью PBS и перемешайте путем инверсии. Далее определите количество жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего с использованием гемоцитометра.

После определения количества клеток центрифугируйте клетки костного мозга с ускорением 913 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. После центрифугирования удалите супернатант, исходя из общего количества клеток. Ресуспендируйте осадок в PBS до концентрации 1 × 10⁸ клеток/мл.

Теперь клетки костного мозга готовы к переносу облученным мышам-реципиентам. Мыши дикого типа и нокаутные мыши-реципиенты для данного эксперимента были облучены дозой 1000 rad, как описано в сопроводительном документе; мыши разведены и содержатся в условиях, свободных от патогенов. Через 4–24 часа после облучения прогрейте мышей-реципиентов на грелке под согревающей лампой перед инъекцией донорского костного мозга. Поместите мышь-реципиента в фиксатор, протрите хвост 70% этанолом, чтобы стерилизовать место инъекции и вызвать местное расширение сосудов для облегчения введения препарата.

С помощью инсулинового шприца с иглой калибра 28,5 введите 1 × 10⁷ клеток в объеме от 1 до 200 µL в хвостовую вену каждой мыши. В течение первых четырех недель после инъекции помещайте мышь в клетку, где находятся до трех других инъецированных мышей. Содержите реципиентов после инъекции в автоклавированных клетках с водой, содержащей антибиотик сульфатримет.

Это дает животным время для восстановления иммунитета; при этом необходимо каждые четыре дня менять клетки, воду и корм с антибиотиками для соблюдения гигиены. Через четыре недели после облучения и трансплантации костного мозга переведите мышей на обычную воду без антибиотиков и содержите их еще две недели для восстановления нормальной микрофлоры кишечника. Через шесть недель после инъекции костного мозга измерьте исходную массу тела перед индуцированием колита.

Мышам в экспериментальной группе с колитом дают питьевую воду с содержанием 5% декстрансульфата. Через пять дней периферическую кровь четырех мышей объединяют в вакутайнерах с гепариновым покрытием и помещают на лед. Затем в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл добавляют 300 µL крови и 300 µL буфера для окрашивания клеток, после чего кровь разделяют по пяти пробиркам для проточной цитометрии под номерами от одного до пяти, добавляя в каждую по 100 µL на льду.

После забива мышей повторно измерьте массу тела и рассчитайте ее изменение. Выделите ткани толстой кишки и поместите их в формалин для окрашивания по H&E. Затем выделите клетки костного мозга, как описано ранее.

Разделите ресуспендированный костный мозг по пяти микроцентрифужным пробиркам с маркировкой от один до пять, по 100 milliliters в каждую. В preparation для анализа методом проточной цитометрии подготовьте смесь антител для каждой соответствующей пробирки в темноте, как описано в сопроводительном документе; образцы крови и костного мозга под номером один будут служить контролями и не будут окрашены. Образцы крови и костного мозга под номером два будут окрашены с использованием изотипического контроля FITC, изотипического контроля PE и блокирующего раствора CD 16/32.

Эти изотипические контроли используются для подтверждения специфичности связывания первичных антител с образцами. Образец под номером три будет окрашен с использованием FZ CD 45.1 и CD 16/32. Образцы блокирующего раствора под номером четыре будут окрашены с использованием CD 45.2 и CD 16/32.

Блокирующий раствор. Одноцветное окрашивание позволяет выявить наличие донорских или реципиентных клеток в крови или костном мозге. Образцы под номером пять будут окрашены на CD 45.1, CD 45.2 и CD 16/32.

Блокировка здесь двухцветного маркирования показывает относительное соотношение донорских и реципиентных клеток в крови или костном мозге. Добавьте 5 µL смеси антител два и пять в соответствующие пробирки с образцами. Затем добавьте 3 µL смеси антител три и четыре в соответствующие пробирки с образцами.

Инкубируйте все пробирки на льду в течение 30 минут. После инкубации добавьте в каждую пробирку по два миллилитра буфера для лизиса XRBC. Затем инкубируйте образцы еще 15 минут на льду в темноте.

Центрифугируйте клетки при 350 ×g в течение пяти минут при 4 °C. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 500 µL буфера для окрашивания клеток в темноте. Затем коротко перемешайте на вортексе.

Затем проведите проточную цитометрию образцов крови и костного мозга с иммуноокрашиванием. Используйте FZ для идентификации дикого типа CD 45.1 и PE для идентификации нокаута CD 45.2. Проанализируйте результаты проточной цитометрии с помощью программного обеспечения Flo Joe.

Рассчитайте отношение fit E к PE или отношение PE к fit e, чтобы определить, является ли генотип донора доминантным генотипом в крови и костном мозге. На этом изображении представлены примеры микрофотографий окраски гематоксилином и эозином (H&E) толстой кишки с нормальной гистологией и колитом, вызванным DSS. Гистологические изображения оцениваются на основе степени повреждения слизистой оболочки и инфильтрации нейтрофилов в слизистый и подслизистый слои.

Таким образом, более высокий гистологический балл указывает на более тяжелое течение колита; этот показатель использовался для проверки того, играет ли lyin роль в предотвращении колита. Костный мозг был пересажен между мышами дикого типа и нокаутных мышами, как описано в данном видео. Затем была проведена гистологическая оценка и расчет баллов, как показано здесь.

Показатели гистологического анализа значительно увеличились при введении костного мозга мышей с нокаутом облученным мышам дикого типа. И наоборот, показатели значительно снизились при введении костного мозга мышей дикого типа мышам с нокаутом. Эти данные указывают на то, что эндогенный C из клеток костного мозга оказывает противовоспалительное действие и облегчает течение колита, что подтверждает успешность трансплантации у данных мышей.

Проточная цитометрия также проводилась с использованием костного мозга и крови мышей после трансплантации. Костный мозг мышей дикого типа интенсивно окрашивается на Fitz CD 45.1, но не на pe, CD 45.2, как показано здесь; костный мозг нокаутных мышей интенсивно окрашивается на PE, но не на Fitz, как показано здесь. Однако после трансплантации как костный мозг, так и кровь мышей дикого типа, получивших костный мозг нокаутных мышей, интенсивно окрашивались на PE, но не на Fitz, что указывает на то, что преобладающая популяция окрашенных клеток была донорской.

Аналогичным образом, костный мозг и кровь мышей с нокаутом, получивших костный мозг дикого типа, интенсивно окрашивались на fitzy, но не на pe, что вновь подтвердило, что основными окрашенными популяциями были клетки донора. После просмотра этого видео вы сможете проводить эксперимент по трансплантации костного мозга и модифицировать течение колита с помощью клеток, производных костного мозга.