Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Целью данной процедуры является визуализация реакций иммунных клеток на бактериальные токсины. Сначала токсин экспрессируют в клетках BL 21 gold, после чего его очищают. После подтверждения активности и концентрации токсина его вводят в иммунные клетки.

Проводится микроинъекция с использованием микроинъектора и высокоскоростная микроскопия живых клеток. Анализ полученных изображений позволяет выявить кинетику иммунного ответа клеток на токсин в режиме реального времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как механизм активации инфламмасомы.

Хотя данный метод позволяет получить представление об иммунных ответах клеток, опосредованных токсинами, его также можно применять к другим стимулам, включая хемотаксические аттракторы. Идея этого метода возникла у нас при изучении взаимодействия бактерий с культивируемыми иммунными клетками, когда мы заметили крайне вариабельный характер этого взаимодействия. Начните очистку стрептолизина O или SLO с культуры клеток BL 21 gold, содержащих PAG three SLO.

Культивируйте плазмиду до достижения OD примерно 0,6. Для индукции экспрессии белка добавьте в культуру пять миллилитров 20% OSes и перемешивайте при 225 RPM при комнатной температуре в течение трех часов. Затем перенесите бактерии в центрифужную бутыль объемом 500 миллилитров.

Затем центрифугируйте культуру при 12,000 ×g в течение 12 минут при температуре 4 °C; после центрифугирования слейте супернатант. Храните осадок при температуре -80 °C в течение ночи или дольше, если это необходимо. Чтобы очистить экспрессированный SLO, добавьте к замороженному осадку 10 мл промывочного буфера для лизиса, дополненного Triton X 100, лизоцимом и фенилметилсульфонилфторидом, и перемешивайте содержимое путем многократного всасывания и вытеснения через пипетку в течение примерно 15 минут.

Для ресуспендирования осадка перевзвесьте его, поддерживая образец на льду. Перенесите ресуспендированный осадок в круглодонную полипропиленовую пробирку Oak Ridge объемом 50 миллилитров. Проведите соникацию лизата с помощью ультразвукового зонда при мощности 40% пять раз по 30 секунд с интервалами в 30 секунд, выдерживая образец на льду в течение 30 секунд между циклами.

Затем центрифугируйте ультразвуковой лизат при 39, 000 ×g в течение 20 минут при температуре 4 °C. После центрифугирования добавьте бактериальный супернатант к одному миллилитру промытых никель-NTA-агарозы. Инкубируйте никель-NTA-агарозу и лизат вместе в течение 2,5 часов при температуре 4 °C при осторожном перемешивании после инкубации.

Осадите гранулы путем центрифугирования при 400 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Обратите внимание, что все последующие промывки и элюция выполняются с использованием этих настроек центрифугирования, если не указано иное. После центрифугирования.

Смешайте 30 µL супернатанта с 10 µL 4-кратного буфера для образцов SDS в микроцентрифужной пробирке и поместите на лед для последующего анализа чистоты. Затем удалите оставшуюся часть супернатанта и четыре раза промойте гранулы в буфере для промывки, центрифугируя после каждой промывки, а затем один раз в солевом буфере. С этого момента обязательно держите образец на льду постоянно.

SLO — это белок, крайне чувствительный к окислительно-восстановительным процессам, и он быстро теряет свою активность при нагреве до 37 °C даже в течение короткого промежутка времени. Для элюции белка SLO добавьте к гранулам один миллилитр элюирующего буфера и пять микролитров 1 M DTT, затем инкубируйте на льду в течение 10 минут. После этого центрифугируйте пробу и соберите супернатант в центрифужную пробирку, помеченную номером элюции.

Повторите этот процесс трижды, затем для удаления эндотоксина из белка SLO добавьте к образцу 200 µL промытых полимиксин-конъюгированных агробидов, суспендированных в солевом буфере res, и перемешивайте при 4 °C в течение 30 минут. Затем центрифугируйте при 10 000 ×g в течение одной минуты при 4 °C. После центрифугирования соберите супернатант в новые маркированные микроцентрифужные пробирки.

Смешайте 30 µL каждого элюата с 10 µL 4-кратного буфера для образцов SDS. Для проведения SDS-ПАГ храните растворы SLO на льду. Определите концентрацию белка и гемолитическую активность; при удовлетворительных результатах разлейте SLOE по 5–10 µL, затем заморозьте на сухом льду и храните при -80 °C.

Затем определите специфический лизис. Рез. Ресуспендируйте тестируемые клетки в двух повторах. Доведите концентрацию до 6×10⁶ клеток на миллилитр в буфере RB с содержанием 20 µg/mL.

Пропидий иодид. В данном случае тестируются клетки T 27 A. Добавьте по 100 µL клеток в каждую лунку V-образного 96-луночного планшета, используя отдельные микроцентрифужные пробирки.

Выполните серийное разведение SLO в буфере rb до концентрации, в два раза превышающей конечную. Затем добавьте к клеткам либо 100 µL токсина, либо 100 µL буфера RB и инкубируйте в течение пяти минут при 37 °C. Типичные конечные концентрации варьируются от 2000 units/mL до 31.25 units/mL.

Пропустите клетки через проточный цитометр и соберите данные, используя фильтры для fi, cethrin или pe. Сдвиг на один логарифм соответствует транзиторно проницаемым клеткам, а сдвиг на три логарифма указывает на погибшие клетки. Рассчитайте специфический лизис клеток, вычтя процент погибших клеток в контроле из экспериментального значения, используя приведенное здесь уравнение; за один день до экспериментов высейте макрофаги в количестве 2×10⁵ на стекло, покрытое коллагеном.

Чашки диаметром 35 мм с плоским дном. Микроскоп, используемый для доставки токсина, должен быть оснащен перевернутым столиком, подогреваемым столиком, соответствующими кубами фильтров возбуждения и эмиссии, а также, при наличии, линзой Бертанна. Самым сложным этапом данной процедуры является аккуратное опускание иглы к клеткам без повреждения ее кончика.

Для обеспечения успеха в работе мы используем линзу Бертрана, которая обычно применяется для юстировки, чтобы визуализировать иглу при ее перемещении через фокальные плоскости. Микроскоп должен быть подключен к микроинжектору и управляться компьютером с достаточным объемом памяти для сбора и хранения данных; включите микроскоп и микроинжектор, дав подогреваемую платформе время на нагрев до 37 °C. В течение этого времени проведите маркировку клеток красителем в течение 30 минут при 37 °C.

В зависимости от анализа маркировку можно проводить с использованием 5 µL, 4 или 2 мМ в 1 mL HBSS или 2 µL кальция в 1 mL полной среды; здесь используются 4 или 2. Удалите среду из клеток и один раз промойте клетки PBS. Аспирируйте PBS и замените его 1 mL RPMI, дополненного 2 mM хлорида кальция.

Установите чашку на микроскоп, сфокусируйтесь на клетках в режиме светлого поля, затем сместите фокус чуть выше уровня клеток. Далее смешайте 1 µL токсина SLO, 4 µL DEXTRA 5 55 в концентрации 10 mg/mL и 6 µL воды. Затем центрифугируйте смесь при 20,000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Декстран используется для проверки того, что фемтозонд не засорен. С помощью микрозагрузочного устройства введите 2 µL разбавленного токсина в фемтозонд с тыльной стороны. Установите фемтозонд в микроинжектор.

Затем отрегулируйте угол наклона инъектора так, чтобы его кончик располагался над центром клеток с возможностью перемещения во всех направлениях; сбросьте предыдущие настройки лимита по оси Z, который ограничивает глубину погружения кончика микроинъектора. Настройте микроинъектор на впрыскивание в течение 0,5 секунд при давлении 120 PSI и противодавлении 20 PSI. Затем опустите кончик до его погружения в среду.

Используйте линзу Бертрана. Отцентрируйте кончик иглы и следите за ним по мере его приближения к клеткам. Когда кончик иглы выйдет из фокуса, вернитесь к обычному режиму оптики.

В поле зрения должна быть видна тень от иглы. Сфокусируйтесь над клетками и опускайте иглу до тех пор, пока она не войдет в фокус. Затем сфокусируйтесь на клетках и осторожно подведите иглу к клетке.

После установки предела по оси Z для инъекции начните визуализацию и введите токсин. Затем поднимите иглу и перейдите к новому участку клеток. Введите дополнительную порцию токсина и продолжайте визуализацию после инъекции.

Переместите иглу в исходное положение, чтобы предотвратить нежелательную утечку токсина из иглы, используя метод, описанный в данном видео: от 10⁷ до 10⁸ единиц на мл. SLO обычно получают при концентрации белка 4 мг/мл. На данном геле SDS-PAGE представлены образцы бактерий до и после индукции токсина, а также после очистки; каждая из трех фракций элюата при окрашивании кумасси синим подтверждает, что индуцированный SLO был успешно очищен.

Для определения количества токсина, необходимого для лизиса клеток T 27 A или D two, использовали полосу 69 килодалтон SLO. Клетки подвергали воздействию различных концентраций SLO в течение пяти минут при 37 °C в присутствии пропидия иодида, после чего исследовали методом проточной цитометрии. Специфический лизис определяли, как показано здесь.

250 единиц на миллилитр. SLO вызывает 50% лизис клеток как T 27 A, так и D two. Сублитическая доза токсина, вызывающая 10% лизис, составит 62,5 единиц на миллилитр.

Эти значения важны для эталонного определения активности токсина с целью оценки гибели клеток после воздействия токсина. Дермальные фибробласты человека инкубировали с кальцием и гомодимером атериума, используя набор для определения живых и мертвых клеток от Life Technologies. После локального воздействия бактериального токсина anthro lysin O. На этом изображении кальций показан зеленым цветом, а бромид атериума — красным; в областях, прилегающих к микробиому, наблюдается гибель клеток, характеризующаяся потерей кальция и поглощением гомодимера ате, в то время как в областях, удаленных от кончика, повреждения отсутствуют.

Микродозирование токсина также позволяет исследовать события в режиме реального времени, такие как поток ионов кальция. Эти человеческие dcs, нагруженные 4:02 AM, подвергались воздействию SLO при постоянной скорости потока с одновременной визуализацией живых клеток, при которой наблюдалось смещение спектра с зеленого на синий. Псевдоцвет указывает на повышение уровня цитозольного кальция.

SLO вызывает быстрый рост концентрации цитозольного кальция, который распространяется по области чашки благодаря локальной доставке. Однако с токсином сталкиваются и на него реагируют только те клетки, которые находятся близко к наконечнику микроинъектора. Это демонстрирует как реакцию отдельной клетки на токсин, так и пространственно ограниченную область доставки токсина для разрешения событий в измерении z.

Метод микродоставки был совмещен с высокоскоростной 3D-конфокальной микроскопией. На данном наборе изображений показаны дендритные клетки после инъекции токсина. Клетки были предварительно инкубированы с анти-CD 11 C, конъюгатом с ПК, который показан зеленым цветом для маркировки плазматической мембраны.

Как видно здесь, после доставки токсина происходит высвобождение микровезикул. В рамках процесса клеточной репарации молекулы токсина концентрируются в блеббах, которые затем отшнуровываются для удаления токсина. После освоения метода микроскопия может быть выполнена за 45 минут.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости хранения токсина в охлажденном состоянии до момента смешивания с клетками, а также о необходимости проверки его гемолитической активности. Теперь, после просмотра этого видео, вы должны хорошо понимать, как измерять кинетику иммунного ответа клеток на бактериальные токсины в режиме реального времени с помощью микроскопии живых клеток.