Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Общая цель данной процедуры — визуализация и количественное определение отдельных субпопуляций специализированных клеток, которые дифференцируются в биопленках модельного организма Bacillus subtilis. Это достигается путем предварительного встраивания транскрипционных репортеров в хромосому B. subtilis. Данные репортеры будут экспрессироваться исключительно в исследуемой субпопуляции клеток.

Следующим этапом является стимулирование развития биопленки путем выращивания B subtles в среде для индукции биопленок, Ms GG gg. После формирования биопленки клетки из нее диспергируют и фиксируют параформальдегидом. Заключительным этапом процедуры является детектирование флуоресцентного сигнала, излучаемого отдельными клетками микробного сообщества, с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

В конечном счете, результаты демонстрируют, как специализируются клетки для продукции и секреции. Внеклеточный матрикс, составляющий биопленку, формируется отдельной субпопуляцией, отличной от клеток, секретирующих сурфактант — сигнальную молекулу, ответственную за дифференцировку субпопуляции продуцентов матрикса. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как количественное определение экспрессии транскриптов с помощью анализа жизнеспособности или микрочипового анализа, является возможность мониторинга экспрессии генов на уровне единичных клеток и визуализации особенно малых популяций клеток, специализирующихся на экспрессии конкретного гена.

Эти экспрессии генов не будут обнаружены при анализе общей популяции. Интегративные плазмиды используются для маркировки B-субтильных элементов; пример представлен здесь. PTAA — промотор генов, ответственных за продукцию tass.

Матриксный белок клонируют в вектор с использованием сайтов рестрикции EcoRI и HindIII. Теперь экспрессия репортерного гена CFP находится под контролем ptapA. Для начала процедуры маркировки B. subtilis линеаризуют интегративную плазмиду путем ферментативного переваривания. Рекомендуемым ферментом рестрикции является XhoI. Когда интегративная плазмида будет готова, индуцируют естественную компетентность штамма B. subtilis 168, выращивая клетки в среде, индуцирующей компетентность, в течение пяти часов при 37 °C.

Добавьте линеаризованную плазмиду в культуру компетентных клеток B subtlest и инкубируйте в течение двух часов при 37 °C. По истечении двух часов высейте клетки на агар с adding spect mycin и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. Хромосома B subtles имеет два нейтральных локуса, Amy, E, E и LAC A, которые могут быть использованы для интеграции репортерных слияний без влияния на развитие биопленки. Линеаризованная плазмида PKM 0 0 8 интегрируется в геном B subtles путем двойной рекомбинации.

Следующим шагом является перенос репортера из меченого штамма в штамм, способный формировать биопленки, с использованием протокола трансдукции фагом SPP one. В данном видео показаны только основные этапы протокола. Вырастите донорский штамм 1 68, содержащий репортерный химерный ген, в среде TY при 37 °C до достижения ранней стационарной фазы, затем добавьте 200 µL клеток и 100 µL разведенного стока фага в стеклянную пробирку.

Выдержите при температуре 37 °C в течение 15 минут. Затем перенесите горячий мягкий агар TY в пробирку и тщательно перемешайте с помощью вортекса. Осторожно распределите смесь по свежей чашке с агаром TY и инкубируйте при температуре 37 °C от 8 до 16 часов до появления гало фагов.

Для сбора фаговых гало добавьте в чашку три миллилитра среды TY и с помощью стеклянной пипетки разрушьте верхний слой агара. Перенесите агаровую суспензию в 15-миллилитровую пробирку Falcon. Осторожно перемешайте на вортексе для полного разрушения агара, затем центрифугируйте при 1000 G в течение 15 минут.

Перенесите супернатант в новую пробирку. Пропустите супернатант через шприцевой фильтр с порами 22 мкм. Используйте этот супернатант для заражения культуры реципиентного штамма, выращенного в среде TY.

Добавьте 30 µL супернатанта к 10 mL культуры, разведенной 1:10, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. После этого центрифугируйте при 5 000 об/мин в течение семи минут, ресуспендируйте осадок в 200 µL среды TY и высейте на чашку с SPECTmycin и 10 мM цитратом натрия.

Инкубируйте при 37 °C от 12 до 36 часов. Выберите колонию и культивируйте ее в течение ночи в жидкой среде LB при 37 °C. Наконец, нанесите три µL ночной культуры на плотную среду, индуцирующую образование биопленки.

Дайте клеткам расти в течение 72 часов при 30 °C. После трех дней роста биопленки, сформировавшиеся на поверхности агара Ms.GG, разовьют сложную морфологическую архитектуру на поверхности агара. Для начала данной процедуры используйте зубочистку или пинцет, чтобы удалить биопленку с поверхности агара MSGG.

Консистенция биопленки должна позволять отделить ее от поверхности агара. Перенесите биопленку целиком в три миллилитра PBS-буфера и аккуратно диспергируйте её. Выполните 12 импульсов с мощностью 3 и амплитудой 0,7 секунды для фиксации образцов перед проведением анализа единичных клеток.

Ресуспендируйте 300 µL клеточной суспензии в 1 мл 4%-ного раствора параформальдегида и инкубируйте при комнатной температуре ровно семь минут. После семиминутной фиксации трижды промойте клетки в PBS-буфере. В завершение ресуспендируйте клетки в 300 µL PBS-буфера перед проведением флуоресцентной микроскопии.

Подготовьте предметное стекло, пипеткой нанеся 200 µL 0,8% agros на стекло и осторожно накрыв его вторым стеклом. Через две минуты аккуратно снимите верхнее стекло, чтобы на нижней области предметного стекла остался слой agros. Нанесите 2 µL фиксированных клеток на поверхность слоя agros и накройте его покровным стеклом.

Поместите образец на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Установите период возбуждения в соответствии с отрицательным контролем, который не проявляет флуоресценции в условиях, выбранных для эксперимента. Время экспозиции должно составлять от 50 до 200 миллисекунд.

Получите изображение с флуоресценцией, а также изображение в светлом поле для каждого поля зрения. Чтобы подготовить клетки для анализа методом проточной цитометрии, диспергируйте образец фиксированных клеток с помощью мягкой соникации. Выполните две серии по 12 импульсов с мощностью 5 и амплитудой 0,7 секунды, чтобы разобрать конгломераты до одиночных клеток, не вызывая лизиса клеток.

Подтвердите эффективность диспергирования клеток с помощью световой микроскопии. Затем разведите образец в 100 раз в PBS-буфере. Для анализа флуоресценции YFP будет использоваться проточный цитометр BD FACSCanto II.

Для регистрации флуоресценции CFP используется лазерное возбуждение на длине волны 488 нм в сочетании с фильтром 5 30 30. Для возбуждения на длине волны 405 нм используется соответствующий фильтр 4 0 8 40; откалибруйте проточный цитометр с помощью двух отрицательных контролей. В качестве отрицательного контроля размера частиц, регистрируемых проточным цитометром, следует использовать образец буфера PBS без клеток в суспензии.

Образец без флуоресцентного репортера должен служить отрицательным контролем для определения чувствительности проточного цитометра к флуоресценции. После калибровки поместите образец, меченный флуоресцентным репортером, в проточный цитометр; для каждого образца проанализируйте не менее 50 000 событий при скорости потока от 303 000 событий в секунду. Когда B Subtles растет на чашке с биопленкоиндуцирующей средой MSGG, образование биопленки наблюдается через три дня инкубации при 30 °C.

Биопленка демонстрирует сложную морфологическую архитектуру, которая указывает на наличие различных участвующих субпопуляций клеток. Например, выработка внеклеточного матрикса и формирование биопленок приводят к появлению складок на поверхности колонии. На данном рисунке представлен пример визуализации дифференциации клеток в одном меченом штамме с помощью флуоресцентной микроскопии.

Данный штамм содержит флуоресцентный репортер Ptap, A CFP, который экспрессируется в субпопуляции клеток, вырабатывающих матрикс, и окрашен в синий цвет. Эта субпопуляция вырабатывает и секретирует внеклеточный матрикс, который образует биопленку. Следующее изображение представляет собой результат визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии штамма с двойной меткой, который содержит репортер Ptap, A CFP и дополнительный репортер P Surfactin YFP.

Этот второй репортер позволяет отслеживать субпопуляцию клеток, ответственных за секрецию сигнальной молекулы сурфактина, которая запускает сигнальный каскад дифференцировки продуцентов матрикса. Здесь продуценты матрикса окрашены в синий цвет, а продуценты сурфактина — в желтый; результаты представлены данными 2D-проточной цитометрии с использованием одного маркированного штамма, несущего репортер ptap. Здесь представлен YFB.

Необработанный контрольный штамм без генов флуоресцентных белков продемонстрировал единую популяцию с низкой относительной флуоресценцией клеток, содержащих ptap. YFP в условиях, не индуцирующих образование биопленки, не дифференцировал субпопуляцию продуцентов матрикса, и вся популяция также показала низкую относительную флуоресценцию. Напротив, в условиях индуцирования образования биопленки была обнаружена субпопуляция клеток с высокой относительной флуоресценцией в виде «плеча» справа от области низкой относительной флуоресценции.

Здесь представлены результаты анализа пиков, полученные методом 3D-проточной цитометрии. Сигналы флуоресценции контролируемых каналов представлены по оси X для YFP и по оси Y для CFP; на верхней левой панели показан штамм без генов флуоресцентных белков в качестве контроля фоновой флуоресценции. На правой верхней панели использован один меченый штамм для обнаружения субпопуляции продуцентов сурфактина в канале флуоресценции YFP, выделенном желтой рамкой.

На нижней левой панели для обнаружения субпопуляции продуцентов матрикса использовался другой отдельный маркированный штамм. В канале флуоресценции CFP, обведенном синим цветом, с помощью дважды маркированного штамма отслеживаются субпопуляции продуцентов матрикса и сурфактанта; результаты представлены на данной нижней правой панели.

Обнаружены две субпопуляции клеток, экспрессирующих высокие уровни флуоресцентных репортеров. Каждая популяция обведена рамкой, демонстрируя отсутствие перекрытия экспрессии репортеров между двумя субпопуляциями специализированных клеток. На этом заключительном рисунке показан количественный анализ субпопуляций продуцентов матрикса и каннибалов, выполненный с помощью 3D-проточной цитометрии.

На верхней правой панели для обнаружения субпопуляции каннибалов использовался один меченый штамм. В канале флуоресценции YFP, обведенном желтым цветом, эта субпопуляция каннибалов была описана как дифференцирующаяся согласованно с субпопуляцией продуцентов матрикса. На нижней левой панели субпопуляция продуцентов матрикса обнаруживается в другом меченом штамме в канале флуоресценции CFP.

На панели в правом нижнем углу результаты для дважды помеченного штамма (выделены синей рамкой) показали наличие одной субпопуляции флуоресцентных клеток, экспрессирующих как YFP, так и CFP (выделены зеленой рамкой). Одновременная экспрессия двух репортеров указывает на то, что оба пути дифференцировки клеток координированно активированы в одной и той же субпопуляции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать и количественно оценивать отдельные субпопуляции клеток, составляющих микробную биопленку, используя методы анализа клеточных популяций, такие как флуоресцентная микроскопия или проточная цитометрия.