Преодоление Био-Электронный интерфейс с Biofabrication

Общая цель следующего эксперимента заключается в электроосаждении биополимерных пленок и их функционализации биологическими компонентами, такими как белки и клетки. Электроосаждение достигается за счет использования локального изменения pH у поляризованного электрода в сочетании с раствором pH-чувствительного полисахарида. При выборе стратегии катодного или анодного осаждения на электрод подается смещение для инициирования золь-гель перехода, в результате чего образуется тонкая пленка с рисунком, определяемым геометрией электродов.

Кроме того, на протяжении всего процесса осаждения на электроде могут вводиться биологические компоненты, такие как белки и клетки. Для биологической функционализации пленки были получены результаты, демонстрирующие локализацию биологических компонентов в пленках на основе флуоресцентной визуализации. Кроме того, было показано, что данные компоненты функциональны и способны взаимодействовать с окружающей средой, что подтверждается электрохимическим детектированием ферментативной активности и использованием отклика репортерных клеток.

Биофабрикация предоставляет новый набор инструментов для создания интерфейса между биологией и электроникой. Мы полагаем, что ее основными преимуществами являются простота и возможность сборки в условиях, близких к физиологическим. Биология специализируется на создании структур на наноуровне посредством самосборки и ферментативных механизмов. Используя эти возможности, мы обходим сложные, опасные и трудоемкие методы синтеза, которые применяются в других техниках сборки.

Идея создания интерфейса устройства BioD с использованием биологических материалов и механизмов возникла у нашей совместной группы исследователей, когда мы заметили, что китан может осаждаться электрохимическим способом. Китан представляет собой рН-чувствительный пленкообразующий полисахарид, который способен распознавать электрические сигналы устройства и осаждаться в виде тонкой пленки. Убедившись в возможности электрохимического осаждения китана, мы поняли, что для создания интерфейса устройства BioD можем использовать более широкий спектр инструментов биохимии и молекулярной биологии.

Применение данной методики распространяется на устройства типа «лаборатория на чипе», где требуются функциональные биологические компоненты, поскольку этот метод обеспечивает дешевый и простой способ локализации таких компонентов на электроде с сохранением их жизнеспособности. Визуальная демонстрация данного метода имеет критическое значение, так как биофабрикованная пленка может быть очень хрупкой и легко повредиться. В связи с этим следует соблюдать осторожность, чтобы не действовать слишком грубо при промывке или облучении пленки.

Поскольку пленка может быть легко повреждена, следует соблюдать осторожность. Однако преимуществом является то, что электроды можно использовать повторно, так как пленка легко удаляется. Чтобы начать выполнение данного протокола, подключите источник питания к изготовленным по индивидуальному заказу электродам с помощью соединительных проводов, используя зажимы типа «крокодил».

Стеклянный предметный предмет, покрытый оксидом индия-олова (ITO), будет выполнять роль анода или рабочего электрода, а платиновая фольга послужит катодом или вспомогательным электродом; расположите электроды так, чтобы поверхность ITO, подлежащая функционализации, находилась напротив вспомогательного электрода, при этом поверхность ITO должна быть расположена либо вертикально для погружения в раствор, либо горизонтально, чтобы раствор мог удерживаться на ее поверхности. Затем приготовьте раствор для осаждения альгината, смешав 1% альгината и 0,5% карбоната кальция в дистиллированной воде, после чего проавтоклавируйте смесь. Затем проведите флуоресцентное мечение альгината с помощью флуоресцентных сфер (Fluor spheres) путем смешивания и вортексирования.

Это позволит проводить флуоресцентную визуализацию полученной пленки. После автоклавирования погрузите оба электрода в подготовленный осадочный раствор и подайте постоянную плотность тока 3 А/м² в течение двух минут. Напряжение будет изменяться в диапазоне от 2 до 3 В. Через две минуты отсоедините электрод и удалите остатки осадочного раствора. Осторожно промойте пленку раствором хлорида натрия, чтобы удалить излишки альгината.

Кратковременно инкубируйте пленку в 0,1 молярном растворе хлорида кальция для укрепления геля. Затем пленку инкубируют в подходящем растворе для хранения. Перед совместным осаждением приступайте к визуализации пленки с помощью флуоресцентной микроскопии.

Вырастите культуру клеток-отправителей сигнала и культуру клеток-получателей сигнала согласно указаниям в письменном протоколе, прилагаемом к данному видео. Затем приготовьте раствор для осаждения из альгината и карбоната кальция. Смешайте этот раствор с каждой из клеточных культур в соотношении один к одному до конечной концентрации 1% альгината и 0.5% карбоната кальция, при этом плотность клеток должна быть разведена примерно до половины исходной плотности культивирования.

Используйте предметное стекло с двумя нанесенными электродами из ITO, ограниченными лункой из полидиметилсилоксана, и платиновым вспомогательным электродом. Подключите один электрод из ITO и платиновый электрод к источнику питания. Как и ранее, погрузите электроды в раствор для осаждения, содержащий клетки-реципиенты.

Установите источник питания в режим постоянного тока с плотностью 3 А/м², где площадь поверхности определяется одним электродом, на котором будет происходить осаждение. Подавайте ток в течение двух минут для совместного осаждения клеток в альгинатном матриксе. Промойте пленку раствором хлорида натрия, как и ранее, и переключите катодное соединение на соседний ITO-электрод.

Повторите процедуру осаждения, но на этот раз введите раствор, содержащий клетки-отправители. Инкубируйте двухэлектродный чип, содержащий совместно осажденные клетки и аргенат кальция, в течение ночи при 37 °C в фосфатно-солевом буферном растворе.

Дополнили средой LB (10%) и хлоридом кальция в концентрации 1 мМ. После инкубации исследуйте чип с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы приступить к осаждению хитозанового электрода. Подключите источник питания к электродам.

Закрепите зажимы типа «крокодил». Золотое покрытие кремниевого чипа будет выполнять функцию катода, а платиновая фольга — функцию анода. Расположите поверхность золотого электрода таким образом, чтобы он находился напротив вспомогательного электрода, как и в предыдущем случае.

Приготовьте раствор песка Като, смешав хлопья песка Като с водой и медленно добавляя двухмолярную соляную кислоту для растворения полисахаридов. Следуя процедуре, описанной в тексте, раствор песка Като можно пометить флуоресцентным красителем для визуализации нанесенной на электрод пленки с помощью флуоресцентной микроскопии. Затем поместите электроды в раствор Като, полностью погрузив область, предназначенную для осаждения.

В течение двух минут подавайте постоянный ток, рассчитанный исходя из плотности 4 А/м² относительно площади поверхности рабочего электрода. В данном случае к золотому электроду площадью 4 мм² подается ток 16 мкА; напряжение будет изменяться в диапазоне от 2 до 3 В. После этого промойте электрод деионизированной водой для удаления излишков хитозана. Перейдите к визуализации пленки с помощью флуоресцентного микроскопа; хитозан и глюкозооксидаза наносятся из раствора на структурированный электрод при плотности тока 4 А/м².

В соответствии с процедурой осаждения хитозана на электрод будет сформирована пленка кайзана с иммобилизованной глюкозооксидазой. Подключите обработанный электрод к трехэлектродной системе в качестве рабочего электрода, платиновую проволоку — в качестве вспомогательного электрода, а хлорид серебра — в качестве электрода сравнения; погрузите электроды в фосфатный буферный раствор, содержащий хлорид натрия. Выполните электрохимическую конъюгацию белка с пленкой кайзана, подавая постоянное напряжение в течение 60 секунд с помощью хронопотенциометрии, после чего проведите конъюгацию.

Поместите чип в фосфатный буфер и промывайте в течение 10 минут на орбитальном шейкере, чтобы удалить остатки не вступившего в реакцию хлорида натрия и неконъюгированной глюкозооксидазы. Снова подключите трехэлектродную систему и погрузите ее в раствор глюкозы с концентрацией 5 мМ. Затем установите необходимые параметры для циклической вольтамперометрии, чтобы провести развертку потенциала в положительном направлении до 0,7 В.

Извлеките электроды из раствора глюкозы и промойте их фосфатным буфером. Затем поместите электроды в стакан объемом 10 мл, содержащий 8 мл фосфатного буфера, на магнитную мешалку. Подайте на чип, функционализированный GOX, напряжение 0,6 В, чтобы он служил рабочим электродом.

После установки необходимых параметров проведите базовую запись. Добавляйте аликвоты глюкозы в буфер для увеличения концентрации глюкозы на 4 mM с каждой аликвотой. В данном эксперименте в буфер добавляют аликвоты 80 mM глюкозы объемом 400 µL. Соотнесите выходной ток с каждой концентрацией глюкозы. Для построения стандартной кривой и проведения функционализации белка используйте предметное стекло с нанесенными соседними золотым и ITO-электродами, заключенными в A-P-D-M-S.

Подайте на золотой электрод катодный потенциал для электроосаждения тизена, как было показано ранее. После промывки пленки добавьте раствор синим флуоресцентно меченного автоиндуктора-2-синтазы с добавлением тирозиназы. Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.

Промойте пленку раствором PBS, как указано ранее, и подайте анодный потенциал на электрод ITO, погруженный в раствор для осаждения альгината, содержащий клетки-реципиенты. Выполните те же действия, что описаны в разделе по совместному осаждению популяций клеток в альгинате, чтобы ферментативно создать передаваемый сигнал. После промывки пленок добавьте раствор 5 µM SAH и PBS с добавлением 10% среды LB и 1 mM.

Накройте электроды хлоридом кальция, чтобы предотвратить испарение раствора, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. Это обеспечит ответ приемной клетки за счет экспрессии красного флуоресцентного белка DS red; прилежащие электроды можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии, настроив фильтры для регистрации синей флуоресценции inducer two synthase и красной флуоресценции, экспрессируемой кооптированными приемными клетками. Наложенные электрические сигналы могут создавать локализованные микроокружения вблизи поверхности электрода, и эти стимулы могут инициировать самосборку полисахаридов, таких как альгинат и разан, с их последующим осаждением в виде гидрогелевой пленки на поверхности электрода.

Поскольку переход из состояния золя в гель происходит на поверхности электрода, полученная пленка подвергается электроадресации, при которой ее геометрия соответствует рисунку электродов. С использованием альгината уникальные популяции клеток были совместно осаждены по отдельным адресам. Доказательство их электродной адресации наблюдается при взаимодействии между популяциями клеток-отправителей и клеток-получателей.

Молекула автоиндуктора два диффундирует из клеток-отправителей и поглощается клетками-получателями, что приводит к экспрессии красного флуоресцентного белка DS red. Здесь красная флуоресценция наблюдается только у электрода, на который воздействуют клетки-получатели. Напротив, биосенсорный фермент глюкозооксидаза обеспечивает возможность обнаружения глюкозы посредством ферментативной реакции с образованием перекиси водорода, которая затем может быть электрохимически окислена для создания выходного тока.

Таким образом, химический сигнал может быть преобразован в электрический. На данном графике показано, что пленки, в которых Geo X был химически конъюгирован, создают сильный антисигнал в присутствии глюкозы, в отличие от пленок, не содержащих Geo X. Эти результаты указывают на то, что Geo X может быть нанесен на осажденную пленку zam и при этом сохранять каталитическую активность. Кроме того, в ответ на увеличение концентрации глюкозы наблюдается ступенчатое увеличение отического тока.

Представленная стандартная кривая также показывает, что ступенчатое увеличение происходило почти линейно в зависимости от количества добавленной глюкозы. Эти результаты демонстрируют, что фермент сохраняет свою чувствительность после конъюгации с пленкой Razza, как показано здесь: I two synthase содержит Penta tyrosine-метку. Тирозиназа воздействует на tyrosine-метку, окисляя фенольные группы остатков до o-хинонов, которые затем ковалентно связываются с аминными группами Kazan; подтверждение функционализации пленки Kazan с помощью I two synthase посредством сборки тирозиназой наблюдается на данном флуоресцентном изображении, где представлена пленка kaza на золоте, а функционализированная I two synthase помечена синим флуоресцентным красителем. Поскольку I two synthase генерирует I two из субстрата SAH аналогично клеткам-отправителям, ее близость к кооптированным клеткам-получателям в присутствии SAH также вызывает флуоресцентный ответ клеток-получателей путем экспрессии ds.

Красная флуоресценция клеток-реципиентов вновь демонстрирует взаимодействие между адресами за счет диффузии ai, двух из одного в другой, и дополнительно указывает на то, что 10 ферментов, иммобилизованных на tizen, сохраняют активность после образования ковалентной связи. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как электроосаждать полисахаридные пленки и как функционализировать их с помощью различных методов. Мы продемонстрировали универсальность этих этапов функционализации, позволяющую нам работать с множеством биологических компонентов в ходе дальнейших испытаний.

После освоения эта техника может выполняться всего за несколько минут для создания четко определенных рисунков пленок, на которые можно точно прививать биологические компоненты. Таким образом, мы можем очень легко создавать биологически структурированные и активные поверхности на заданных электродах, причем весь процесс организован и при этом позволяет достигать сложных биологических взаимодействий. После выполнения данной процедуры можно проявить творческий подход как при проектировании электродной матрицы, так и при выборе биологических компонентов для достижения заданного взаимодействия.

Мы надеемся, что инструменты биофабрикации станут связующим звеном между двумя разрозненными областями — биотехнологией и микроэлектроникой, каждая из которых по отдельности произвела революцию в нашей жизни. Мы полагаем, что объединение этих двух областей позволит создать новые решения некоторых из наиболее острых проблем общества. Например, мы предполагаем, что биофабрикация может предложить простые и универсальные методы для новых способов сенсорики, диагностики заболеваний в месте оказания медицинской помощи, а также обнаружения биологических и химических угроз.

Одним из примеров перспективного развития может стать создание артериального стента следующего поколения, который будет способен не только поддерживать проходимость артерии, но и осуществлять мониторинг вашего метаболического профиля.