Микрофлюидных устройство для изучения нескольких различных штаммов

Общая цель следующего метода заключается в визуализации поведения отдельных клеток дрожжей различных штаммов в одинаковых динамических условиях. Это достигается путем изготовления двухслойного микрофлюидного устройства, где нижний слой будет содержать каждый из различных штаммов по отдельности, а верхний слой на втором этапе обеспечит условия динамического потока. Различные штаммы дрожжей помещают в лунки, после чего устройство закрывают, создавая единый канал с несколькими разделенными штаммами.

Далее мы регистрируем ответы клеток на динамические изменения среды. Путем контроля скоростей потока в двух входных отверстиях Y-образного канала мы получаем результаты для различных штаммов, подвергнутых одним и тем же динамическим условиям, при отсутствии перекрестного загрязнения между лунками. Данное микрофлюидное устройство обладает несколькими ключевыми преимуществами по сравнению с другими существующими системами. Оно позволяет проводить визуализацию нескольких различных штаммов в одинаковых динамических условиях.

Кроме того, что немаловажно, данное устройство можно легко изготовить в любой лаборатории без необходимости в специальном оборудовании. Этот метод возник в ходе обсуждения того, как отслеживать ответы различных диких изолятов с Востока на пассажи с голоданием. Для начала начертите или распечатайте желаемую схему микроканалов в масштабе.

Затем покройте предметное стекло слоями скотча. Чтобы добиться нужной высоты канала, положите шаблон на плоскую поверхность и совместите стекло с рисунком шаблона. Теперь аккуратно вырежьте скотч на предметном стекле в соответствии с шаблоном. Удалите скотч со всех остальных областей предметного стекла.

Зафиксируйте их в структуре микроканала. Поместите предметное стекло в нагревательный шкаф при температуре 65 °C на три минуты. Затем аккуратно очистите этанолом.

Смешайте основу и отвердитель PDMS в соответствии с рекомендациями производителя. Налейте около 30 миллилитров смеси PDMS в чашку Петри до высоты примерно 0.5 сантиметров. При необходимости удалите пузырьки воздуха из PDMS в вакууме.

Погрузите предметное стекло в PDMS так, чтобы сторона с нанесенным рисунком из скотча была направлена вверх. Нанесение рисунка перед заливкой PDMS предотвращает образование пузырьков воздуха между стеклом и дном чашки. В новую чашку Петри диаметром 90 мм налейте 3 mL смеси PDMS. Полимеризуйте в течение 48 часов при 65 °C, убедившись с помощью пузырькового уровня, что чашка расположена горизонтально.

Данный этап можно выполнить с помощью центрифужного кодера, если он имеется в наличии. Проведите дегазацию и отверждение, как показано ранее. Теперь аккуратно вырежьте слой потока микрофлюидного устройства до нужного размера с помощью биопсийного панча.

Проделайте отверстия для впускных и выпускных отверстий в потоковом слое. Также вырежьте слой лунок аналогичного размера из второй чашки Петри и поместите его на толстое стекло. Наложите сверху схему расположения элементов.

Затем с помощью этанола пробийте отверстия в соответствии с расположением микроканалов на схеме, очистите оба слоя PDMS и стеклянное покровное стекло и высушите их на воздухе. Далее обработайте покровное стекло и слой PDMS с отверстиями либо в стандартном установке плазменного травления для необратимого склеивания, либо с помощью ручного коронатора для обратимого склеивания. Осторожно поместите слой с отверстиями поверх покровного стекла для обеспечения адгезии.

Осторожно удалите все пузырьки воздуха. Подготовьте необходимые среды в подходящих шприцах и подсоедините их к тигоновой трубке, пропущенной через шприцевой насос. Для визуализации клеток.

Используйте соответствующие концентрации. Перейдите к нужной фазе, тщательно перемешайте культуру на вортексе и перенесите 300 µL в микроцентрифужные пробирки. Осторожно внесите 1 µL con canna A в каждую лунку слоя с лунками из PDMS.

Дважды удалите избыток конканавалина А из каждой лунки, осторожно пипетируя воду, пока конканавалин А высыхает. Дважды промойте штаммы 300 µL среды SC без глюкозы. Удаление остаточной глюкозы со стенок клеток способствует надлежащей адгезии к конкавалину.

После перемешивания на вортексе с помощью пипетки осторожно перенесите примерно 0.5 µL клеточной суспензии в отдельные лунки. Аккуратно промойте остатки клеток богатой средой. Следующие два этапа необходимо выполнить быстро, чтобы предотвратить высыхание клеток.

В качестве дополнительного этапа обработайте чип и лунки плазмой, стараясь не воздействовать на лунки напрямую. Затем под стереомикроскопом аккуратно поместите чип на лунки, уделяя особое внимание их точному совмещению. Слегка прижмите, чтобы два слоя PDMS плотно приклеились друг к другу.

Медленно заполните устройство примерно 50 µL богатой среды, следя за тем, чтобы внутри канала не осталось пузырьков воздуха. Теперь подключите устройство, вставив трубки в соответствующие входные отверстия, и запустите поток среды. Следите за тем, чтобы в трубках не образовывались пузырьки воздуха, так как они могут застрять в устройстве и нарушить поток.

Поместите устройство под микроскоп и найдите в каждом лунке подходящие точки для визуализации. Поддерживайте поток питательной среды через лунки в течение одного часа или дольше, если это необходимо для восстановления клеток.

Начните эксперимент с установкой постоянного потока. Установите скорость насоса А на 0.8 milliliters per hour, а насоса B — на 0.2 milliliters per hour. Среда должна протекать по более чем 80% ширины канала.

Мы можем динамически изменять условия в устройстве, варьируя относительную скорость потоков. Новые условия стабилизируются в течение нескольких секунд по всей длине канала. Для демонстрации разделения различных штаммов в чередующихся лунках визуализируются два различимых штамма дрожжей.

Обратите внимание, что в данном эксперименте утечка клеток между лунками отсутствует. Оба штамма содержат транскрипционный фактор MSN2, меченный YFP, для проверки одновременного эффекта динамически меняющихся условий. Скорости потока в двух входных каналах были изменены для создания ступенчатого перехода к среде без глюкозы.

Это привело к локализации MSN two в ядре. Важно отметить, что можно анализировать динамику уровней YFP MSN two в ядрах отдельных клеток. Таким образом, микрофлюидное устройство из ПДМС может быть использовано для создания одновременных динамических условий в нескольких лунках.

При выполнении данной процедуры важно следить за тем, чтобы клетки не пересыхали во время сборки устройства. После освоения этот метод можно выполнять легко, без необходимости применения мягкой литографии.