Визуализация Бактерии в Нематоды использованием флуоресцентной микроскопии

Общая цель данной процедуры — наблюдение за флуоресцентно мечеными бактериями-симбионтами внутри нематоды-хозяина. Это достигается путем предварительной метки бактерий флуоресцентным белком посредством конъюгации. Вторым этапом является выделение нематод AIC путем сбора яиц.

Затем нематоды AIC выращивают совместно с их флуоресцентно-меченым бактериальным симбионтом, чтобы обеспечить естественное взаимодействие и, в конечном счете, локализацию бактериального симбионта внутри нематоды-хозяина. Частоту такого взаимодействия в популяции нематод можно определить с помощью флуоресцентной микроскопии. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области симбиоза, такие как: где локализуются бактерии внутри своего хозяина и каково распределение бактериального носительства в популяции хозяев?

После ночного выращивания бактериальных штаммов перенесите субкультуры донорского, реципиентного и хелперного штаммов в богатую питательную среду без антибиотиков в соотношении культуры к среде 1:100, затем культивируйте их при температуре, соответствующей каждому штамму, до достижения середины логарифмической фазы роста. Далее объедините штаммы в одной микроцентрифужной пробирке и центрифугируйте смешанные культуры в течение двух минут при 17 900 Gs, слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 30 µL свежей среды. Затем нанесите суспензию каплей на чашку с богатой питательной средой без антибиотиков и дождитесь высыхания капли.

Инкубируйте планшет в перевернутом виде в течение ночи при температуре, оптимальной для реципиентной бактерии и допустимой для донора и хелпера, если они используются. Затем снимите содержимое пятна и произведите посев штрихом на селективный агарозный планшет с антибиотиком для получения чистой культуры бактерий, выбрав одну колонию для изоляции. В завершение убедитесь, что полученные колонии являются реципиентным симбионтом, а не донорным штаммом.

Путем скрининга на наличие специфических фенотипов реципиента. Например, бактерии cino abdi можно отличить от e coli, проведя тест на каталазу; скрининг на наличие плазмиды проводится путем подтверждения флуоресценции при длине волны, соответствующей флуоресцентному белку плазмиды. После overnight-культивирования природного бактериального симбионта распределите 600 µL бактериальной культуры на 8–10 10-миллиметровых липидных агариков, затем инкубируйте планшеты в темноте без доступа влаги при 25 °C.

Через два дня добавьте на бактериальные газоны 5 000 инфективных ювенильных нематод в 500 µL среды. После инкубации планшетов при 25 °C в течение еще трех дней нанесите 20 µL воды на предметное стекло. Затем с помощью стерильной палочки соберите небольшое количество нематод с бактериального газона.

Поместите палочку в воду, чтобы нематоды могли уплыть. Рассмотрите этот препарат под малым увеличением. Если видны яйца и самки, продолжите процедуру; при наличии яиц в самках налейте несколько миллилитров воды на поверхность чашек, аккуратно перемешайте содержимое круговыми движениями, а затем перелейте воду в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Нематоды должны отделиться от чашек и более не быть видимыми на их поверхности. Дайте нематодам осесть на дно пробирки, затем удалите излишки воды с поверхности пробирки с помощью пипетки и снова наполните пробирку чистой водой. После того как взрослые нематоды осядут и излишки воды будут повторно удалены пипеткой, наполните конические пробирки раствором с яйцами.

Затем перемешайте содержимое пробирок путем осторожного переворачивания в течение ровно 10 минут при комнатной температуре. После перемешивания немедленно центрифугируйте конические пробирки в течение ровно 10 минут при 1,250 Gs и комнатной температуре с включенным торможением. Затем быстро слейте супернатант, ресуспендируйте осадок в яичном растворе с помощью пипетирования и заполните коническую пробирку свежим яичным раствором.

Тщательно перемешайте суспензию яиц, перевернув пробирку три-пять раз, затем немедленно осадите яйца центрифугированием и слейте супернатант, как было показано ранее. Ресуспендируйте осадок в бульоне M9 или LB с помощью пипетирования, после чего перенесите суспензию яиц в коническую пробирку объемом 15 мл. Теперь заполните пробирку объемом 15 мл бульоном LB, трижды промойте яйца в бульоне, используя ту же технику быстрого осаждения, что была продемонстрирована, а затем разведите ресуспендированные яйца нематод P. pacificus до концентрации не менее 10 яиц на 1 µL.

Перенесите яйца в чашку Петри диаметром 6 см, содержащую 5 мл LB и антибиотики против колонизирующих бактерий. Чашку можно хранить, обернув пленкой, до четырех дней после ночного выращивания и селекции флуоресцентных бактерий. С помощью стерильной палочки распределите 600 µL бактериальной культуры по 10-мм липидным дискам и инкубируйте культуру при 25 °C.

Через два дня распределите от 500 до 5 000 яиц нематод на каждую липидную чашку. Если чашки хранились, перед инокуляцией яиц на предварительно подготовленные бактериальные газоны промойте яйца в 15 миллилитрах LB, как было продемонстрировано выше, как минимум один раз. Затем инкубируйте кокультуры нематод и бактерий в темноте без избытка влаги при 25 °C до появления инфекционных личинок в виде пушистого белого кольца по краю чашки.

После того как будут обнаружены инфекционные личинки, снимите крышку с чашки с липидным агаром и поместите дно этой чашки на дно пустой чашки Петри размером 100 мм на 20 мм. Затем налейте в чашку Петри достаточное количество воды, чтобы она достигала примерно половины высоты меньшей чашки, и инкубируйте эту водную ловушку до тех пор, пока дочерние инфекционные личинки не выйдут в воду.

После сбора нематод из воды или на нужной стадии жизненного цикла с соответствующего бактериального газона растворите несколько крупинок ole в 30 µL воды и добавьте от одного до двух µL этого парализующего агента на каждые 50 µL образца нематод. Затем перенесите примерно 20–30 µL парализованного образца нематод на предметное стекло и накройте его покровным стеклом. Осмотрите нематод с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться, что они находятся в поле зрения.

Для определения локализации бактерий сфотографируйте нематод с помощью флуоресцентной микроскопии в дополнение к световой микроскопии, а затем наложите изображения друг на друга. Для поиска бактерий может потребоваться использовать несколько вариантов увеличения и ракурсов обзора нематоды.

Популяции нематод из двух сред были подсчитаны, и была проведена оценка степени их колонизации бактериальным симбионтом. Для получения достоверных статистических данных рекомендуется подсчитать не менее 100 нематод на образец, при этом в каждую категорию, представленную в таблице, должно попасть не менее 30 особей. Степень колонизации данных нематод составляет приблизительно 14,6% при выращивании на липидном агаре и 68,6% при выращивании на агаре с печенью и почками.

Было показано, что другие виды нематод и бактерий имеют разный уровень колонизации. На данной схеме представлен общий вид самок Steiner NEMA. На вставке показано изображение самки S fot, полученное с помощью дифференциально-интерференционного контраста при 20-кратном увеличении.

Черная стрелка на врезке указывает на вульву, в то время как белые стрелки указывают на видимые яйца. На этом изображении показано развившееся, но не вылупившееся яйцо нематоды volt при 40-кратном увеличении, а данные яйца, выделенные из нематод s Volta, были сфотографированы при 10-кратном увеличении. Здесь, на первом изображении, представлены типичные микроскопические снимки нематод Steiner Nima, ассоциированных с бактериями Xeno aptus.

Для создания этого композитного изображения нематоды Альвина были совмещены с их бактериальным симбионтом, экспрессирующим GFP. Изображение, полученное с помощью фазового контраста, было наложено на флуоресцентное изображение. Стрелка указывает на бактерии, находящиеся внутри инвазионной личинки нематоды.

На этом изображении показана ювенильная нематода S carpa capsi с экспрессирующим GFP белком X nla. Изображение было создано аналогично предыдущему и демонстрирует ювенильную нематоду, в которой бактерии, меченные зеленым флуоресцентным белком, визуализируются в виде зеленых палочек, локализованных по всему просвету кишечника нематоды. В дополнение к описанной процедуре могут быть внедрены другие методы, такие как генетическая манипуляция бактериями-симбионтами перед их ассоциацией с нематодой-хозяином, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о молекулярных механизмах, необходимых для ассоциации хозяина и микроба.