Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за распределением вирусных геномов в делящихся клетках. Это достигается путем предварительного создания плазмиды, которую можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии. В данном случае плазмида конструируется таким образом, чтобы она содержала тандемные повторы последовательности оператора лактозы или LAC O. Вторым этапом является введение плазмиды в делящиеся клетки с последующим заражением этих клеток ретровирусом, кодирующим репрессор лактозы или lac I, слитый с флуоресцентным белком.

Слитые белки-репрессоры лактозы будут специфически связываться с операторными последовательностями лактозы в плазмиде sub. Клетки контролируют с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы отслеживать отдельные плазмиды на протяжении нескольких клеточных циклов. В конечном итоге полученные изображения обрабатываются для определения того, как вирусные геномы сохраняются в делящихся клетках.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как количественная ПЦР, Саузерн-блоттинг или флуоресцентная гибридизация in situ, является то, что она позволяет наблюдать за отдельными плазмидами в несколько моментов времени. Для обеспечения визуализации плазмиды с помощью флуоресцентной микроскопии используются стандартные методы молекулярного клонирования для введения в плазмиду фрагмента ДНК, содержащего приблизительно 250 копий операторной последовательности лактозы или LAC O. В данном примере используется BAC-мид размером около 170 килобаз, который содержит весь геном герпесвируса ассоциированного с болезнью Капоши или KSHV и кодирует устойчивость к гигромицину.

Введите плазмидную ДНК, содержащую LAC O, в клетки млекопитающих HeLa и SLK путем трансфекции. В чашках диаметром 60 мм инкубируйте клетки в течение четырех часов с 10 µg очищенной плазмидной ДНК, 25 µL Lipofectamine 2000, 0,5 mL Opti-MEM и 3,5 mL DMEM. Замените среду на DMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки и оставьте клетки для восстановления на 48 часов.

Затем высейте трансфицированные клетки с низкой плотностью в большие чашки и культивируйте их в течение трех недель в среде DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки и 300 µg/mL гигромицина для селекции по введенной плазмиде; используйте кусочки стерильных наконечников и смоченную фильтровальную бумагу для переноса гигромицин-резистентных колоний в новые культуральные чашки. Поместите чашки в инкубатор; через одну-две недели, когда трансфицированные клоны разрастаются и заполняют чашку, выделите ДНК для рестрикционного анализа и саузерн-блоттинга, чтобы убедиться, что полимер плазмиды LAC O гомогенен и имеет ожидаемый размер. На данном примере блота видно, что полимер LAC O в клоне один гомогенен и идентичен полимеру положительного контроля.

В седьмой дорожке, если плазмида не была сконструирована для экспрессии слиянного белка репрессора лактозы lacI, заразите подходящие клоны ретровирусом, кодирующим lacI, слитый с красным флуоресцентным белком, таким как tdTomato; tdTomato выбирают вместо белков, флуоресцирующих в зеленом спектре, чтобы минимизировать фототоксичность, возникающую при многократном облучении в течение длительного времени. После введения слиянного белка lacI культивируйте клетки в присутствии 200 µg/mL IPTG, чтобы предотвратить связывание слиянных белков с ДНК. Одним из наиболее критических аспектов данной процедуры является получение клонов с соответствующей интенсивностью флуоресценции.

Для выявления клонов с оптимальной флуоресценцией следует провести скрининг большого их количества. Культивируйте клетки в течение как минимум трех дней, чтобы обеспечить экспрессию белка LacI-tdTomato; отберите клоны с оптимальным уровнем экспрессии LacI-tdTomato, которые дают четкий сигнал при минимальном уровне фона несвязанного слитого белка. За 24–48 часов до визуализации высейте экспрессирующие LacI-tdTomato клетки в стеклянную чашку с дном диаметром 35 мм при плотности менее 10% конфлюэнтности. Это позволит парам клеток разделиться в колонии по 8–16 клеток без перекрывания за 1–3 часа до начала визуализации.

Трижды промойте планшет культуральной средой, не содержащей ни селективных препаратов, ни IPTG. Это позволяет вымыть нежизнеспособные клетки и дает возможность белкам слияния lac eye связаться с LAC-цитами в плазмидах. Замените культуральную среду на два миллилитра DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки и 25 мМ Hippies; инкубируйте от одного до трех часов. Непосредственно перед получением изображений замените верхнюю часть чашки с культурой на культ-фольгу, натянутую в монтажном кольце для 35-миллиметровой чашки.

Эта крышка предотвратит испарение питательной среды, которое со временем привело бы к повышению концентрации солей и гибели клеток. Система визуализации, используемая в данном эксперименте, состоит из инвертированного микроскопа Zeiss Axio 200 M, оснащенного моторизованным предметным столиком и EM CCD-камерой для высокочувствительной регистрации сигналов. Флуоресцентное возбуждающее освещение обеспечивается нейтральным белым светодиодом системы Collibra.

Система визуализации управляется программным обеспечением для автоматического получения изображений в течение длительных интервалов времени с созданием нескольких Z-стеков. Для поддержания клеток при температуре 37 °C и содержании углекислого газа от 5 до 10% в увлажненной камере используется инкубатор, устанавливаемый на предметный столик. Чтобы предотвратить эффект сифонирования объектива, для масляного объектива используйте подогревающий кожух.

Прогрейте образец, чтобы система успела достичь стабильной температуры. Для минимизации артефактов движения во время эксперимента систему визуализации следует разместить на пневматическом столе для изоляции от вибраций. Чтобы начать процедуру визуализации меченой ДНК, используйте дифференциально-интерференционный контраст (DIC) для осмотра клеток и определения фокальной плоскости верхней и нижней границ клеток в нескольких полях зрения; в каждом поле перейдите на фокальную плоскость, расположенную примерно на одной трети глубины от верхней границы клетки, и сохраните координаты x, y, Z в списке сохраненных положений предметного столика.

Каждая из этих сохраненных позиций станет центром Z-стека изображений для захвата клетки в программном обеспечении управления микроскопом; определите Z-стек изображений, который будет выполнен в каждой сохраненной позиции предметного столика, и задайте достаточное количество срезов, чтобы захватить клетку целиком, включая дополнительные срезы выше и ниже плоскостей, в которых расположены клетки. Выберите размер шага по Z от 0.35 до 0.50 microns, чтобы обеспечить приближенное к критерию Найквиста сэмплирование в направлении Z. Эти срезы позволяют отслеживать перемещения клеток в течение клеточного цикла, а также используются при последующей обработке полученных стеков изображений.

В результате получится стек из 40–60 изображений, в зависимости от толщины клеток. Настройте эксперимент с временными рядами для получения изображений Zacks в светлом поле с интервалом в 30 минут и флуоресцентных изображений с интервалом от 10 до 60 минут. Не используйте дифференциально-интерференционный контраст (DIC) во время эксперимента, так как он требует большего количества света, чем стандартная микроскопия в светлом поле, что может привести к излишней фототоксичности клеток в ходе длительных экспериментов.

Запустите эксперимент под управлением программного обеспечения. Убедитесь, что в ходе эксперимента система не подвергается никаким внешним воздействиям. После получения всех изображений для эксперимента просмотрите снимки для каждого Z-стека и временной точки, обрезав ненужные области изображений для сокращения времени компьютерной обработки.

На следующем этапе следует заново сопоставить интенсивность сигнала с исходным пикселем в каждом Z-стеке. Для этого в программном обеспечении Axio vision используется алгоритм деконволюции, основанный на измеренной функции рассеяния точки данной системы визуализации. Результат деконволюции представлен здесь.

Изучите изображения, чтобы проследить за изменением интенсивности и перемещением плазмид в течение клеточного цикла, а также за распределением плазмид между дочерними клетками. Эти изображения, созданные вычислительным путем с объединением нескольких Z-плоскостей, в которых расположены различные сигналы, показывают, что ядра клеток HELOC, экспрессирующих LAC eye TD tomato, флуоресцируют благодаря наличию сигнала ядерной локализации в составе слитого белка, который направляет его в ядро. При добавлении IPTG геномы, кодирующие последовательности LAC O, привлекают множество копий флуоресцентного белка и проявляются в виде ярких сигналов на фоне интенсивности свечения ядра.

Напротив, в присутствии IPTG флуоресцентные белки LAC не связываются со своей последовательностью распознавания lacO; на данном рисунке представлены максимальные проекции интенсивности Zack, полученные для одной клетки в пяти временных точках в ходе репрезентативного эксперимента. Флуоресцентно меченные вирусные геномы в клетке, видимой на панели A, синтезируются, как показано на панели B. Затем вирусные геномы распределяются между дочерними клетками при делении, что наблюдается на панелях C, D и E. Клеточный цикл здоровых клеток HELOC длится примерно 24 часа, при этом дочерние клетки обычно прикрепляются друг к другу и продолжают делиться одновременно в следующем клеточном цикле.

Используя данный протокол, можно отслеживать вирусные геномы в клетках на протяжении нескольких поколений. При выполнении этой процедуры важно следить за морфологией клеток в период генерации, чтобы убедиться, что клетки остаются здоровыми на протяжении всего эксперимента.