Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

Общая цель данной процедуры заключается в измерении сна, определяемого по ЭЭГ, и концентрации лактата во время оптогенетической стимуляции в точных стереотаксических координатах. Хирургическим путем имплантируйте необходимые электроэнцефалографические электроды и канюли для лактатного датчика и оптоволоконного кабеля. Затем введите оптоволоконный кабель и предварительно откалиброванный лактатный датчик в соответствующие направляющие канюли в черепе животного.

Затем отрегулируйте интенсивность стимуляции синим светом для достижения желаемого электрофизиологического ответа. После этого перейдите к сбору данных электроэнцефалографии, электромиографии и концентрации лактата, пока животное находится в состоянии спонтанного поведения или сна. По сравнению с другими методами, такими как фармакологические исследования ЭЭГ, данный экспериментальный подход имеет преимущество в виде возможности мониторинга биохимии и электрофизиологии мозга при манипулировании активностью нейронов в режиме реального времени с субсекундным временным разрешением.

Таким образом, существует высокий потенциал для получения новых данных в области исследований сна. Например, можно определить метаболические и электрофизиологические признаки медленноволнового сна. Этот тип экспериментов может быть применен и в других областях нейробиологии, таких как изучение обучения и памяти, синаптическая пластичность или эпилептические расстройства.

Данная хирургическая техника сложна с технической точки зрения. Она требует определенной сноровки, которой можно достичь путем практики. В этой визуальной демонстрации я последовательно разберу критические этапы некоторых сложных хирургических процедур, которые дополнят письменное описание.

После того как животное восстановится после операции, основной задачей станет правильная установка датчика лактата и оптоволоконного кабеля. Джонатан и я продемонстрируем, как правильно фиксировать животное, чтобы безопасно ввести эти два хрупких элемента оборудования. В завершение мы покажем, как оптимизировать ЭЭГ-ответ, регулируя интенсивность стимула в режиме реального времени.

Для данного эксперимента используйте трансгенных мышей, экспрессирующих чувствительный к синему свету катионный канал. Канал экспрессируется в нейронах коры головного мозга. Сначала анестезируйте мышь, используя 5% isof fluorine и 95% oxygen для индукции, поддерживая последующую анестезию смесью 3% isof fluorine и 97% oxygen.

Сделайте медиальный разрез на верхней части черепа от области между глаз до затылка. Очистите череп перекисью водорода и стерильным физиологическим раствором. Найдите и отметьте точки брегма (B) и лямбда (Lambda) для определения стереотаксических координат для конфигураций оптогенетической стимуляции электродов. Просверлите отверстия под винты с помощью высокоскоростной стоматологической бормашины, используя сначала шаровидный бор диаметром 0.5 мм, а затем шаровидный бор диаметром 0.7 мм.

С помощью шлицевой ручной отвертки вкрутите винты для электродов в отверстия. Вкручивайте их примерно на четыре-пять оборотов, чтобы достичь нужной глубины. Зафиксируйте направляющие канюли с помощью стереотаксического держателя, затем прикрепите их к черепу и анкерам акриловым цементом. Для поддержания проходимости в каждой направляющей канюле должен находиться имитационный стержень или стилет с момента проведения операции до начала экспериментов.

После установки ЭЭГ-электродов и направляющих канюль в череп закрепите их вместе тонким слоем стоматологического акрилового цемента. После затвердевания цемента расположите пластиковый коннектор над высохшим цементным основанием; припаяйте концы проводов, идущих от ЭЭГ-отведений, к контактам пластикового коннектора на случай, если провода окажутся в цементе. Затем проведите провода электромиограммы через мышцы ядра, просунув их в канюлю иглы 21-го калибра.

Проколите мышцу и завяжите двойной узлом хирурга нейлоновую нить 5-0 вокруг этих проводов чуть дистальнее места их выхода из мышцы. Зашейте кожу, которая была раздвинута для доступа к мышечной ткани, одиночными прерывистыми узлами хирурга, используя иглу P3 с обратным режущим краем и нейлоновую нить 5-0. После программирования блока стимуляции MC используйте его в качестве автономного генератора сигналов с пятивольтовым бинарным сигналом «вкл-выкл». Подключите блок стимуляции MC к блоку питания лазера с поддержкой TTL с помощью BNC-разъемов.

Подключите блок питания лазера к лазеру с помощью шлейфного кабеля. Также подключите лазер к разъему FC типа «папа» исходного волоконно-оптического патч-корда. Подключите исходный волоконно-оптический кабель к поворотному соединению.

Оптоволоконный вращательный коммутатор служит в качестве коммутатора. По мере перемещения животного по клетке вращательный joint вращается, чтобы предотвратить разрыв оптоволоконных кабелей из-за крутящего момента. С помощью пластиковых кабельных стяжек закрепите коммутатор на металлической стойке, расположенной над цилиндрической клеткой, в которой содержится животное.

Зафиксируйте мышь, прижимая её одной рукой под ладонью, сложенной лодочкой. Расположите голову так, чтобы она находилась между средним и указательным пальцами экспериментатора. После этого очистите направляющую канюлю от загрязнений, используя стерильную иглу 25G.

Затем вручную введите оптоволоконный кабель и закрепите его в канюле-направляющей с помощью резьбового колпачка. Контролируйте глубину погружения оптоволоконного кабеля в мозг по шовному узлу, завязанному на кабеле на фиксированном расстоянии от плоского скола. Датчик выравнивают в фосфатно-солевом буферном растворе, после чего подвергают воздействию трех концентраций L-лактата последовательным образом.

Согласно протоколам производителя, вставьте предварительно откалиброванный датчик в установленную в черепе направляющую канюлю для лактата способом, идентичным процедуре введения волоконно-оптического кабеля. Подключите датчик лактата к предусилителю биосенсора Pinnacle 8, 400 с помощью биполярных штекерных разъемов. Затем подсоедините этот предусилитель к восьмиконтактному разъему на хирургически имплантированном головном креплении.

Перед началом сбора данных используйте ручку регулировки интенсивности лазера, чтобы настроить интенсивность оптогенетического стимула. Амплитуда ответа ЭЭГ будет варьироваться у разных животных из-за факторов, которые не были изучены систематически. Поэтому необходимо отрегулировать интенсивность оптогенетического стимула и убедиться, что при достижении желаемого ответа амплитуда ЭЭГ является адекватной.

Сбор данных осуществляли с помощью системы Pinnacle 8, 400 с использованием программы neuro score. Интерфейс SEIA позволял классифицировать состояния сна путем визуального анализа данных ЭЭГ и ЭМГ. Данные в десятисекундных эпохах разделяли на бодрствование, сон без быстрых движений глаз или сон с быстрыми движениями глаз на основании показателей ЭЭГ и ЭМГ.

На данной конфигурации оптогенетической стимуляции с биосенсором показаны хирургически имплантированные электроды ЭЭГ, датчик лактата и канюля для оптогенетической стимуляции. В отсутствие оптогенетической стимуляции у этой мыши наблюдался спонтанный сон. Переходы в состояние бодрствования происходили при непрерывном мониторинге ЭЭГ-ЭМГ и концентрации лактата в головном мозге в состоянии бодрствования и при двух подтипах сна.

Фазы быстрого и медленного сна определяются на основании данных ЭЭГ и ЭМГ. Примечательно, что ток лактатного биосенсора растет при низкой амплитуде ЭЭГ и падает при ее высокой амплитуде. Оба канала ЭЭГ реагируют на оптогенетические стимулы, подаваемые в фронтальную кору.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как провести хирургическую имплантацию мыши для одновременного оптогенетического воздействия и измерения электроэнцефалограммы, электромиограммы и концентрации лактата в мозге. При должном навыке эта хирургическая процедура может быть выполнена за 90–120 минут. Помните о необходимости постоянного мониторинга дыхания животного в качестве показателя глубины анестезии.

Если частота дыхания животного составляет менее одного раза в четыре-пять секунд, анестезия может быть слишком глубокой. Если животное дышит чаще одного раза в две секунды, анестезия может быть слишком поверхностной. Помните о необходимости соблюдения соответствующих мер безопасности при использовании газообразного анестетика изофлурана.

Обеспечьте надлежащую вентиляцию в операционном блоке, чтобы защитить сетчатку глаз от лазера, используемого для оптогенетической стимуляции. Используйте защитные очки или поместите животное в светонепроницаемую камеру. Рекомендуется потренироваться в имплантации биосенсора лактата и оптоволоконного кабеля на полностью пробужденной мыши.

Мыши не подчиняются этим процедурам, поэтому их необходимо иммобилизовать. Однако фиксация не должна быть настолько сильной, чтобы травмировать животное или затруднить дыхание.