Передача вирусов растений Использование Белокрылки

Общая цель данного эксперимента заключается в передаче растительных вирусов с помощью белокрылок. Это достигается путем создания и поддержания колонии белокрылок, которая еженедельно обеспечивает вылетание новых взрослых особей, не зараженных другими потенциальными переносчиками и патогенами. Колонии поддерживаются путем регулярного помещения белокрылок на молодые растения, свободные от насекомых, на которых затем развиваются новые взрослые особи.

Через 17–20 дней каждую неделю newly emerged adults можно переносить на тестовые растения для получения или передачи вируса. Обычно достигается эффективность почти 100%, при этом показатели передачи, как правило, начинают с низких значений и растут по мере систематической оптимизации. Наиболее сложным аспектом использования белокрылок для инокуляции вирусов является их разведение таким образом, чтобы исключить попадание нежелательных патогенов и насекомых.

Патогены, в частности грибы, вызывающие корневую гниль, и возбудители ожога листьев, снижают качество растений-хозяев вируса. Нежелательные насекомые, такие как трипсы, могут подавлять размножение белокрылки, а также ухудшать качество растений-хозяев вируса. Процедуры продемонстрирует Хизер Капа Бьянко, техник моей лаборатории.

Колонии белокрылки следует содержать в чистой и контролируемой камере выращивания. Для поддержания колонии, в которой развитие от яйца до взрослой особи занимает 18 дней, крайне важен контроль относительной влажности, температуры, фотопериода и интенсивности освещения; используйте следующие настройки. Температура должна составлять от 26 до 30 °C, а относительная влажность в идеале должна быть в пределах от 30 до 50%. Если относительная влажность превысит 70%, могут возникнуть проблемы с насекомыми и грибковыми патогенами растений.

Идеальный фотопериод составляет 14 часов. Интенсивность освещения должна быть достаточно высокой; люминесцентные лампы VHO могут обеспечивать от 800 до 1000 фут-кандел на уровне кроны растений. Дозы удобрений и полив также необходимо сократить, чтобы предотвратить развитие грибковых патогенов и накопление солей. Клетки Уайтли должны обеспечивать вентиляцию, легкость доступа и достаточное пространство для растущей популяции.

Хорошие результаты были получены при использовании органзы в сочетании с алюминиевым экранированием, а также при использовании белого светонепроницаемого экрана. Выбор вида растения является важным аспектом. Во-первых, оно должно быстро расти, но при этом не перерастать камеру. Во-вторых, растение должно быть достаточно выносливым, чтобы выдержать высокую популяцию насекомых без увядания.

По этим причинам для выращивания хорошо подходят карликовые или кустовые сорта. В-третьих, растение должно либо быть восприимчивым, либо устойчивым к используемому вирусу, в зависимости от типа создаваемой колонии. Поскольку колония может погибнуть из-за клещей, трипсов, диких белых мух или других инвазивных насекомых, выбранные сорта необходимо выращивать в защищенной среде, исключающей попадание других насекомых.

Первые белокрылки новой колонии не должны быть заражены растительными вирусами, содержать других насекомых или патогенов насекомых. Если белокрылки собраны в полевых условиях, их следует разводить в течение не менее восьми недель на растениях, не являющихся хозяевами данного вируса, при этом необходимо контролировать отсутствие симптомов заболевания растений. После получения «чистых» белокрылок перенесите от 20 до 100 особей в клетку с растениями с помощью аспиратора или осторожно стряхнув их с другого растения-источника.

Каждую неделю необходимо заводить новую клетку. В течение первых трех недель для заселения новой клетки используйте белокрылок с растений, не подвергавшихся ST. Начиная с четвертой недели, для заселения следующей клетки используйте молодых взрослых особей белокрылки из трехнедельной клетки.

В течение первой недели пребывания в клетке белокрылки будут откладывать яйца на нижней стороне листьев растений. На второй неделе появятся нимфы белокрылок, при этом часть взрослых особей всё ещё будет жива. На третьей неделе выведется множество новых взрослых особей, и должно произойти очень заметное увеличение популяции взрослых белокрылок.

Этих белокрылок можно использовать для экспериментов по передаче вируса. На четвертой неделе взрослых особей в возрасте одной недели следует перенести в новую клетку. Старую клетку необходимо удалить, а растения в ней — утилизировать. Точно.

Аккуратный перенос белокрылок осуществляется с помощью аспиратора и пробирок для сбора; никогда не используйте аспирацию вслепую. Белокрылки, питающиеся на растениях в момент переноса, глубоко погружены в ткани растения, и если попытаться потянуть их, они могут быть повреждены. Чтобы избежать этого, при сборе белокрылок одной рукой держите желтый пластиковый экран внутри клетки с колонией, а другой рукой проводите сбор.

Осторожно постучите по растениям, чтобы заставить взрослых белокрылок взлететь. Белокрылки полетят на желтую карточку, где их можно будет собрать. С помощью аспиратора, используя очень слабое всасывание, перенесите не более 20 белокрылок в каждый флакон для сбора.

Затем слегка постучите по пробирке, чтобы дезориентировать мух, и закройте пробирку с помощью парафильтра. Для обеспечения успешной передачи вируса перенесите от 15 до 40 молодых взрослых особей с растений, зараженных вирусом, на здоровые растения, в зависимости от типа вируса и растения-хозяина. Другие протоколы, такие как скрининг на устойчивость, требуют использования более крупных стартовых популяций.

В этом случае встряхните зараженные вирусом растения, на которых находятся белокрылки, над растениями, подлежащими инокуляции. После того как белокрылки будут помещены на зараженное вирусом растение, дайте им питаться в течение 48–72 часов для приобретения персистентно передаваемых вирусов. Увеличение этого времени обычно не повышает скорость передачи вирусов, передающихся неперсистентным или полуперсистентным способом.

Для экспериментов, требующих забора из конкретных листьев, будет достаточно сокращенного периода нагула от одного часа до одного дня. Можно использовать зажимы-клетки; установите клетку так, чтобы нижняя сторона листа была доступна. Не используйте более 10 самок белой мухи на клетку диаметром 2,5 сантиметра, иначе скорость передачи снизится из-за скученности. Для инокуляции растений выберите подходящую клетку, исходя из количества растений.

Например, одному растению требуется лишь небольшая клетка, которая лишь немного превышает его размеры; для нескольких растений можно выбрать вариант с трубкой из ПВХ меньшего диаметра, клеткой с каркасом или более крупной клеткой с алюминиевым каркасом. Чем меньше свободного пространства вокруг кроны растения, тем лучше. После помещения белокрылок на новое растение время, необходимое для инокуляции, зависит от конкретного вируса и растения-хозяина.

Как и в случае с приобретением, время, необходимое для передачи, зависит от способа передачи. Непостоянная передача требует гораздо меньшего времени доступа, чем полупостоянная или постоянная передача. Убедитесь, что белокрылки зондируют или питаются в период доступа для инокуляции.

Откройте клетку и осмотрите нижнюю сторону нескольких листьев на каждом растении. При более длительных периодах инокуляции периодически осторожно встряхивайте растения, чтобы стимулировать перераспределение насекомых по растениям.

Это позволит повысить скорость передачи, противодействуя естественной склонности белокрылок к агрегации в конце периода инокуляции. Уничтожьте белокрылок, применив два инсектицида последовательно. Сначала примените контактный инсектицид, такой как инсектицидное мыло, для быстрого уничтожения взрослых особей белокрылки.

Во-вторых, примените системный инсектицид, чтобы уничтожить любых белокрылок, которые появятся в последующие недели. Для этого эффективными вариантами являются имидаклоприд или пиразимон. При использовании данных процедур можно регулярно достигать уровня передачи вируса 100%. Столь высокие показатели передачи необходимы при скрининге тестовых растений на устойчивость к вирусу и желательны при оценке эффективности химических соединений по их способности препятствовать передаче вируса.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как разводить белокрылок и использовать их для передачи растительных вирусов. Эти процедуры могут быть использованы в исследовательских целях, для коммерческой разработки устойчивых к вирусам растений или для тестирования соединений на предмет их способности препятствовать передаче вируса.