Количественные измерения иммунного ответа и сна в

Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке сна и иммунной функции у drosophila. Сначала это достигается путем регистрации локомоторной активности инфицированных мух для измерения сна, а вторым этапом, после инфицирования, мух гомогенизируют, разбавляют и высевают на чашки с агаром LB. Количество выросших колониеобразующих единиц указывает на способность мух элиминировать инфекцию.

Затем инфицированных мух, экспрессирующих трансген, содержащий люциферазный репортер NF kappa b, переносят в 96-луночный планшет с люциферианом, который является субстратом люциферазы. Измерение активности люциферазы kappa b в режиме реального времени указывает на активацию сигнального пути NF kappa B в ходе инфекции, что в совокупности определяет выживаемость при сне. Элиминация бактерий и активность репортера NF KB являются показателями, которые позволяют получить представление о молекулярной связи между иммунной функцией и поведением.

Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, испытывают трудности, поскольку навык стабильного ручного заражения мух требует времени и практики. Главным преимуществом метода, описанного в работе Lucifer, перед существующими методами, такими как QPCR, является возможность непрерывного измерения активности NF Kappa B в режиме реального времени в живых мухах. Начните с инкубации культур Drosophila на поздней стадии куколки в течение трех-четырех дней, чтобы взрослые особи адаптировались к условиям окружающей среды.

В данном случае мух содержат при постоянном освещении, чтобы исключить влияние циркадных ритмов на иммунный ответ и поведение. Затем мух в возрасте от одного до четырех дней помещают в мониторы активности. Мониторы регистрируют их активность в течение минимум трех дней до инфицирования, включая один день непосредственно перед запланированным заражением.

С помощью стерильного наконечника пипетки выберите одну колонию SIA и погрузите наконечник в культуральную пробирку, содержащую пять миллилитров среды LB, чтобы подтвердить соблюдение правил стерильности. Не забудьте создать контрольную ложную культуру без бактерий. Инкубируйте бактерии в течение ночи до наступления экспоненциальной фазы роста на следующий день.

Измерьте оптическую плотность культуры при 600 нм. В качестве холостой пробы используйте вторую Q vet. Культура готова, когда значение оптической плотности составляет от 0,5 до 1 единицы; в противном случае проведите пересев или увеличьте время культивирования по мере необходимости.

Теперь подготовьте бактериальный раствор для заражения мух. Разбавьте бактерии в PBS до ожидаемого значения абсорбции 0,1 при 600 нанометрах. Затем добавьте пищевой краситель для контроля инъекции.

Замените бактериальную суспензию средой LB. Храните оба раствора на льду. Затем с помощью микропипетного вытягивателя изготовьте инъекционные иглы с тонким кончиком под dissecting-микроскопом.

С помощью тонкого пинцета отломите кончик каждой иглы так, чтобы отверстие было достаточно большим для заполнения инъекционной жидкостью при помощи всасывания, но при этом достаточно малым, чтобы свести к минимуму повреждение мухи. Прикрепите стеклянную иглу к пластиковому шприцу объемом 3 cc с помощью отрезка трубки. Поток инъекционной среды контролируется вручную.

Избегайте загрязнения резиновой трубки жидкостью для инъекций, так как шприцевый аппарат используется как для инфицирующих, так и для контрольных инъекций. Проверьте поток среды для инъекций с помощью салфетки Kimwipe. Двумя критическими факторами для успешного проведения инъекций являются использование иглы оптимального размера и надежная герметизация соединения между иглой и шприцем.

После полной подготовки системы для инъекций анестезируйте мух, используя минимальный поток углекислого газа; действуйте быстро, чтобы ни одна муха не находилась под воздействием анестезии более пяти минут. Теперь выполните инъекцию, вводя стеклянную иглу в область над склеритом спинной стороны груди. Прохождение инъекционного раствора в организм мухи подтверждается пищевым красителем, который становится виден по мере распространения вводимого раствора.

Перед началом работы убедитесь, что все материалы, используемые в данной процедуре, были автоклавированы не менее чем за сутки до начала. Подготовьте чашки Петри диаметром 10 см с агаром LV. В день проведения эксперимента анестезируйте мух и поместите их в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.

Подготовьте минимум две группы по 10 мух в каждой для каждого экспериментального условия. Также подготовьте контрольную группу неинфицированных мух, особенно при использовании бактериального штамма без антибиотикорезистентности. Храните все заполненные пробирки на льду.

Затем добавьте по 400 µL среды LB в каждую пробирку с мухами. Гомогенизируйте мух с помощью небольшого пестика, проводя эту операцию рядом с пламенем горелки для предотвращения контаминации. Теперь, используя обрезанные наконечники дозатора, проведите серийное разведение гомогената в 10 раз в объемах по 200 µL.

Если гомогенат готовится сразу после инфицирования sia, сделайте разведения до 1:1000, а для гомогената спустя 24 часа после инфицирования — до 1:100 000. Затем высейте два наибольших разведения на 10-сантиметровые чашки, используя стеклянные шарики для обеспечения равномерного распределения, и инкубируйте чашки в течение ночи. На следующий день подсчитайте количество колоний на чашке путем прямого наблюдения или с помощью программного обеспечения для подсчета колоний.

Затем рассчитайте количество колониеобразующих единиц на одну муху. В данном анализе в подходящее время используются трансгенные мухи, несущие репортер люциферазы kappa b. Для анализа также требуются культивированные бактерии, такие как SCIA, подготовленные для инъекции согласно описанию в предыдущем разделе.

Адаптируйте мух к экспериментальным условиям освещения. В данном примере мухи линии kappa b luciferase в возрасте от одного до четырех дней содержатся в пробирках с питательной средой, состоящей из 5% sucrose и 2% agar, и выдерживаются при постоянном свете в течение двух дней. Теперь подготовьте 96-луночный микропланшет для мух.

Заполните каждую лунку двумя слоями питательной среды. Сначала добавьте в каждую лунку 300 µL 5% раствора сахарозы и 2% раствора агара. Накройте планшет мелкой сетчатой тканью и дайте ему полностью высохнуть в течение одного часа.

Затем в каждую лунку добавьте верхний слой объемом 50 µL, содержащий 5% sucrose, 1% agar и 2 mM Lucifer. Поскольку Lucifer чувствителен к свету, дайте планшету высохнуть в темноте и в дальнейшем сводите воздействие света на планшет к минимуму.

После того как агар остынет, накройте чашку прозрачной адгезивной пленкой. Затем с помощью тонкой иглы сделайте два прокола в пленке над каждой лункой. Эти отверстия обеспечивают газообмен и газовую анестезию.

Затем, для облегчения загрузки мух, с помощью острого лезвия и линейки сделайте прорези между каждой колонкой. Анестезируйте мух углекислым газом и поместите их по одной в каждую лунку, двигаясь по колоннам. Если муха застрянет на пленке, дайте ей возможность освободиться самостоятельно, прежде чем вмешиваться.

Поместите планшет с микролунками обратно в инкубатор при постоянном освещении на период от 8 до 24 часов. Для анестезии мух, находящихся в лунках, используйте наконечник микропипетки, подключенный к линии подачи углекислого газа низкого давления. Убедитесь, что давление газа находится на безопасном низком уровне, и расположите наконечник микропипетки непосредственно над вентиляционными отверстиями, чтобы индивидуально анестезировать мух в группах по восемь особей.

Перенесите каждую муху на подложку с CO2 и инфицируйте их бактериями, как описано ранее. Затем верните каждую муху в соответствующую лунку и снова герметично закройте микропланшет. Измерьте люминесценцию каждой мухи с помощью люминометра, расположенного в помещении с контролируемым температурным режимом и определенным графиком освещения.

Загрузите планшеты в стекирующую кассету, убедившись, что планшеты с мухами расположены между чистыми пустыми планшетами. Настройте люминометр в соответствии со спецификациями производителя и регистрируйте показания каждый час в течение минимум 24 часов. В данном примере детекторы запрограммированы на считывание каждой лунки в течение 10 секунд.

По завершении экспортируйте файлы данных в электронную таблицу и проведите стандартный анализ с построением графиков результатов. Можно проанализировать примеры данных. Значения снижения за секунду рассчитаны как среднее из трех измерений для каждой лунки.

Мухи дикого типа Canton S и мутантные мухи relish. E 20 с делецией гена NF kappa B были помещены в два монитора активности при постоянном освещении и инфицированы sia. В данном примере инфекция способствовала сну.

Было очевидно, что мутанты relish E 20 спали меньше, чем контрольные мухи Canton s после инфицирования. В соответствии с предыдущими данными, мутанты relish E 20 также быстрее погибали от инфекции по сравнению с мухами дикого типа.

Большинство мух пережили контрольную инъекцию в асептических условиях, что указывает на то, что гибель мух была вызвана инфекцией, а не травмой вследствие инъекции. Поскольку мутанты relish погибали очень быстро, для демонстрации бактериальной нагрузки после инъекции использовались только мухи линии Canton S. Sia продолжала размножаться в организме мухи спустя 24 часа после инфицирования.

Активность репортера люциферазы демонстрировала значительную вариабельность как между отдельными мухами, так и между последовательными точками данных. Хотя сигнал поступает от всех тканей организма мухи, не следует ожидать, что каждая ткань будет излучать одинаковый объем сигнала, и видимость тканей для детектора может меняться по мере движения мухи. В данном примере инфицированные мухи сравнивались с контрольной группой, подвергшейся аналогичным манипуляциям.

Мухи, погибшие в ходе эксперимента, были исключены из анализа группы. Активность репортера люциферазы Kappa b неуклонно растет после инфицирования. Активность репортера люциферазы Kappa b также неуклонно возрастала после асептического повреждения.

Пик активности наблюдался примерно через 12 часов как после травмы, так и после инфекции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как количественно оценить иммунную функцию и сон у SSO после инфекции. Мы можем измерять продолжительность сна, выживаемость, время, клиренс бактерий и активность репортера транскрипции в режиме реального времени.