Производство и использование контрейлерные Multibarrel Электроды для

Данная процедура предназначена для ионофоретического введения фармакологических агентов в микроцепи мозга с одновременной регистрацией нейронной активности. Сначала вытяните стеклянный электрод с одним каналом для регистрации активности одиночных клеток и согните его кончик. Также вытяните многоканальный стеклянный электрод и обломите его кончик до достижения требуемого диаметра.

Перейдите к сборке двух электродов. В конечном итоге полученный электрод используется для внеклеточных записей in vivo, при которых по мере необходимости могут быть применены фармакологические агенты для манипулирования нейронными микроцепями. Здравствуйте, меня зовут доктор Ахим Клю, и сегодня наша лаборатория покажет вам, как изготовить многоканальные электроды типа «piggyback».

Эти электроды могут быть использованы для ионофореза нейрональных агонистов и антагонистов в микроокружение нейрона и, таким образом, для манипулирования нейронными цепями нейрона in vivo. Здравствуйте, я доктор Ан Зиллоу. Я постдок в лаборатории доктора Ахима Кроу, и сегодня я продемонстрирую данную процедуру. Для изготовления одноканального электрода используйте стеклянный капилляр с одним каналом и нитью, вытянув кончик до диаметра примерно 1–2 µm при длине стержня 10–12 mm.

Периодически проверяйте сопротивление вытянутого электрода, заполняя его 3 M раствором хлорида натрия и тестируя с помощью стандартного омметра в 0,9% физиологическом растворе. Поскольку после заполнения электрода солевым раствором он быстро высыхает, что делает электрод непригодным к использованию, проводите данную проверку только при необходимости.

Выберите несколько электродов, которые не будут использоваться для создания многоканального (piggyback) электрода. Чтобы создать полноценный многоканальный электрод, вытяните стекло до получения кончика пипетки с общим диаметром около 10 мкм или менее. Использование электрода с правильно вытянутым кончиком является критически важным для достижения успеха.

Помимо того, что наконечник должен быть длинным и тонким, он также должен оставаться твердым, чтобы его можно было легко обломить до желаемого диаметра. На следующем этапе наконечник будет обломан до нужного диаметра. Таким образом, при процессе объединения (pooling) точный размер наконечника менее критичен, чем общая форма кончика электрода, который должен быть длинным и относительно тонким.

Теперь удерживайте одноканальный электрод под углом примерно 45 градусов кончиком вниз и относительно быстро перемещайте его в пламени. Пламя должно расплавить стекло в переходной области примерно в 10 мм от кончика электрода, чтобы согнуть его примерно на 20 градусов. Поместите многоканальный электрод в слой модельной глины на предметном стекле, а затем установите его на предметный столик микроскопа.

Держатель предметного стекла. С помощью XY-манипуляторов предметного столика микроскопа осторожно подведите кончик электрода к кусочку плексигласа. Наблюдайте за отделом кончика через окуляры микроскопа. Здесь показана схема установки электродного узла.

Многоканальный электрод закреплен на предметном стекле на столе микроскопа. Одноканальный электрод удерживается ручным многоосевым манипулятором, который позволяет пользователю с высокой точностью опустить одноканальную пипетку на многоканальную. Опустите одноканальный электрод непосредственно в паз многоканального электрода, образованный расположением пяти каналов, так, чтобы его кончик выступал за кончик многоканального электрода примерно на 5–10 µm.

Склейте стержни двух электродов с помощью цианоакрилата. Начните с области, наиболее удаленной от кончиков, и медленно перемещайте зубочистку с каплей клея вдоль стержней электродов по направлению к их кончикам. Нанесение клея слишком близко к кончикам электродов приведет к их засорению, что сделает электрод как минимум частично нефункциональным.

Смешайте небольшое количество стоматологического цемента. Дайте ему высохнуть в течение примерно 15 минут. Затем осторожно извлеките готовый электрод-«пиггибэк».

Сначала снимите электрод из держателя микроманипулятора, затем отделите его от предметного стекла. Непосредственно перед использованием электрода подготовьтесь к заполнению каждого канала соответствующим препаратом. Заполните четыре внешних канала в пятиканальной конфигурации четырьмя выбранными препаратами, а центральный канал — 3 M раствором хлорида натрия в качестве балансирующего канала.

Затем заполните электрод для регистрации из одного канала 3 M раствором хлорида натрия. Теперь включите модули насосов для ионного перенесения и протестируйте все каналы. Функция тестирования электродов в каждом модуле насоса поможет определить, пригоден ли канал электрода для глубокой регистрации сигналов мозга.

Готовый пятиствольный электрод, собранный вместе с одноствольным регистрирующим электродом, имеет длинный стержень длиной около семи миллиметров. При ионтофорезе обычно используют несколько синаптических агонистов и антагонистов для блокирования глицинового торможения с помощью таких препаратов, как антагонисты глициновых рецепторов. Гидрохлорид стрихнина обычно увеличивает частоту разрядов нейронов.

Эти выборочные данные измеряют функцию зависимости частоты разрядов слуховых нейронов от интенсивности и демонстрируют ответы на синусоидальные звуковые стимулы возрастающей интенсивности, подаваемые в уши животного. Более громкие звуки приводили к более высокой частоте спайков до применения строгого ограничения. Функция зависимости частоты разрядов нейронов от интенсивности показывает низкую частоту спайков.

Подача начального тока ионтофореза силой 15 nano amps стимулирует небольшое увеличение тока выброса. Постепенное увеличение тока выброса приводит к блокированию все большего числа глициновых рецепторов нейрона, что вызывает прогрессивное повышение частоты разрядов. При силе тока 45 nano amps все глициновые рецепторы данного нейрона, по-видимому, блокируются стрихнином гидрохлоридом.

Дальнейшее увеличение тока выведения и высвобождение еще более строгого количества не привело к дополнительным изменениям. Функция уровня частоты разрядов нейронов после прекращения ионтофореза возвращается к исходному уровню примерно через 25 минут. Этот процесс восстановления зависит от типа и количества выведенного препарата.

Важно помнить, что препарат будет диффундировать в область сайта регистрации и может также блокировать рецепторы соседних нейронов. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как сочетать регистрирующий электрод с многоканальным электродом для введения препаратов, чтобы обеспечить глубокую регистрацию активности мозга с низким уровнем шума, а также контролируемую по времени подачу до четырех фармакологических агентов.