Общая цель данной процедуры заключается в выделении везикул F1 F zero APAs из мозга крысы для проведения записей методом патч-клампа. Это достигается путем первоначального извлечения мозга крысы и его гомогенизации. Вторым этапом является разрушение синаптических зон путем приложения давления.

Затем синаптосомы наносятся на градиенты в пробирках. Заключительным этапом является инкубация с дигитонином и L-лизолецитином для получения конечных везикул для регистрации методом патч-кламп. Важной функцией митохондрий является выработка ATP посредством окислительного фосфорилирования.

Фермент, ответственный за выработку АТФ, — это АТФ-синтаза, локализованная во внутренней мембране митохондрий. Чтобы детально изучить функцию АТФ-синтазы, мы выделяем специальные субмитохондриальные везикулы, которые мы называем SMV. Они содержат фермент АТФ-синтазу в инвертированной («вывернутой наизнанку») конфигурации.

Затем мы регистрируем эти SMV с помощью электрода для локальной фиксации потенциала (патч-кламп) и определяем степень проницаемости их мембран. Это позволяет судить об эффективности продукции TP митохондриями. Сегодня эту процедуру продемонстрирует Сильвия Ти, постдокторант моей лаборатории в Йельском университете.

В данной процедуре после отделения головы крысы путем декапитации сделайте разрез кожи для обнажения черепа, затем аккуратно вскройте череп, разрезав его ножницами или ронгеуром. После этого извлеките мозг, измельчите его (без мозжечка), затем перенесите в изоляционный буфер, а затем в стеклянный тефлоновый гомогенизатор объемом 5 мл; осторожно гомогенизируйте ткань 10 раз, затратив в общей сложности около пяти минут. После этого центрифугируйте образец в настольной центрифуге при 1 500 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Сохраните супернатант, содержащий митохондрии и синаптосомы, а осадок удалите. Затем повторно центрифугируйте его при 16 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C в настольной центрифуге. После этого удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 500 µL изоляционного буфера; разрушьте синаптосомы с помощью сосуда для дезинтеграции клеток, приложив давление 1 200 PSI в течение 10 минут с последующей быстрой декомпрессией. Нанесите разрушенные синаптосомы на центрифужные пробирки с двумя различными концентрациями Фиколла, что позволит сформировать два слоя.

Затем поместите пробирки в ротор SW 50.1 и центрифугируйте при 126 500 ×g в течение 20 минут при температуре четырех градусов Цельсия. В ультрацентрифуге осадком являются очищенные митохондрии. Слой между разными плотностями в пробирке представляет собой неразрушенные синаптосомы.

После этого промойте осадок путем центрифугирования в буфере для выделения при 16 000 ×g в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия в настольной центрифуге. Затем ресуспендируйте митохондрии в 200 µL буфера для выделения, смешанного с равным объемом 1% digitonin.

Поместите образец на лед на 15 минут. Затем добавьте дополнительный изоляционный буфер и центрифугируйте при 16 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Повторите эту процедуру дважды, затем ресуспендируйте осадок в 200 µL изоляционного буфера, добавьте 2 µL 10% смеси Lu bra PX и поместите на лед на 15 минут.

После этого распределите смесь по слоям в центрифужных пробирках, используя изолирующий буфер. Поместите пробирки в ротор SSW 50.1 и центрифугируйте при 182 000 ×g при температуре 4 °C в течение одного часа. Через час.

Промойте конечный осадок, центрифугируя его в изоляционном буфере при 16,000 ×g в течение 10 минут при температуре four degrees Celsius. Типичная установка для электрофизиологии включает усилитель, ПК с DigiData 1,440, интерфейс аналого-цифрового преобразователя в сочетании с программным обеспечением pClamp 10.0, манипуляторы, микроскоп, виброизоляционный стол и клетку Фарадея. Сначала вытяните пипетку из боросиликатной стеклянной капиллярной трубки с помощью микропипеточного вытягивателя с нагревом.

Оптимальное сопротивление пипетки должно составлять от 80 до 100 МОм. Добавьте субмитохондриальные везикулы в физиологический внутриклеточный раствор. Затем заполните патч-кламп пипетку тем же раствором.

Визуализируйте везикулы с помощью фазово-контрастной микроскопии после того, как SMVs будут зафиксированы методом патч-клампа при комнатной температуре. Записывайте активность, поддерживая мембранный потенциал в диапазоне от -100 millivolts до +100 millivolts, удерживая каждое значение в течение 10 секунд.

Записанные данные фильтруются на частоте 5 kHz с помощью схем усилителя и анализируются с использованием программного обеспечения Clampfit 10.0. На этом рисунке представлен вестерн-блот лизата, приготовленного из цитозоля и митохондрий. На верхней панели показан иммуноблот с использованием антител к цитозольному белку GAdh.

На нижней панели показан блот с использованием антител к белку внутренней мембраны митохондрий Cox four. Здесь представлены две репрезентативные записи методом патч-клампа до и после добавления 1 mM ATP. Поддерживающий потенциал составляет +70 mV. Пунктирная линия соответствует 0 pA.

Каждая запись регистрируется в течение 10 секунд с 10-секундным интервалом между ними. Ниже представлены примеры графиков изменения интенсивности флуоресценции индикатора CMA с течением времени в присутствии SMV, а также в отсутствие и присутствии TP. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать митохондрии и субмитохондриальные везикулы, содержащие F1 FO ATP-синтетазу. Кроме того, вы должны понять, как сформировать резистивную печать с электродом на мембране везикулы для анализа активности канала комплекса ATP-синтетазы.