Массовые цитометрии: Протокол для ежедневного настройка и запуск образцы клеток на Цитометр массовой CyTOF

Основная цель данной процедуры — продемонстрировать правильную ежедневную настройку и анализ образцов на приборе CyTOF. Сначала выполняется сборка и включение прибора. Затем настройки прибора оптимизируются для достижения максимального сигнала при калибровке.

После этого прибор готов к анализу образцов. На заключительном этапе проводится очистка прибора и его выключение. В итоге это позволяет получить оптимальные данные о клетках в соответствии с конкретными временными требованиями.

Визуальная демонстрация данной методики имеет решающее значение. Процедуры ежедневной настройки, калибровки и очистки сложно освоить по руководству, так как они включают несколько одновременных программных этапов.

Вам необходимо набраться опыта, чтобы почувствовать подходящие уровни фона и интенсивность сигнала. Минимум за 15 минут до начала эксперимента откройте программу управления CyTOF и выберите настройку прибора (instrument setup). Затем на вкладке корзины с картриджами (card cage) нажмите кнопку включения нагревателя (heater on), чтобы кожух распылительной камеры прогрелся до 200 °C.

Замените шприц в шприцевом насосе на новый шприц, заполненный водой Milli-Q. Затем очистите небулайзер, дважды промыв каждый порт в обратном направлении 5% раствором Citron. Чтобы удалить остатки Citron, повторите обратную промывку водой Milli-Q.

Затем откройте клапан баллона с аргоном, после чего на передней панели прибора загорится индикатор Argonne. Затем подсоедините распылитель к входу вспомогательного газа и соедините распылитель с трубкой для подачи жидкости. Вставьте конец распылителя в белое отверстие в нагревательном кожухе на вкладке RFG контроллера в окне настройки прибора.

Нажмите «start plasma», затем нажмите «okay». После завершения запуска снова нажмите «okay» в появившемся окне. Теперь включите шприцевой насос.

При повторном наполнении шприца нажимайте кнопку stop, а не pause, чтобы сбросить счетчик объема. Перед калибровкой масс-цитометра убедитесь, что прибор прогревался в течение 20 минут. После стабилизации работы устройства нажмите кнопку настроек сбора данных (acquisition settings), чтобы открыть окно настроек сбора данных. Перейдите на вкладку аналитов (analytes).

Нажмите на периодическую таблицу, чтобы открыть панель выбора изотопов. Затем выберите изотопы, входящие в состав калибровочного раствора DVS sciences, указанные в руководстве, и нажмите кнопку сохранения. Далее нажмите кнопку «isotopes per reading», чтобы открыть окно выбора масс для каждого измерения.

Выберите количество импульсов и измените масштаб оси y, введя новое число и нажав клавишу enter. Теперь заполните зеленый одномиллилитровый шприц для стандартного ввода калибровочным раствором. Поверните селектор порта пробы в положение load.

Введите 450 µL калибровочного раствора, затем переведите селектор в положение ввода (inject). Дождитесь появления изотопов калибровочного раствора в виде полос на этом дисплее. Сигналы в области времени пролета от 9 400 до 9 800 обусловлены изотопами ксенона в аргоновом газе.

Теперь вернитесь к окну масс по окнам считывания и нажмите зеленую кнопку воспроизведения. Каждая цветная линия представляет выбранные изотопы из вкладки аналитов. Когда уровни изотопов стабилизируются, настройте выбираемый ток с помощью выпадающего меню во вкладке параметров окна настроек сбора данных.

В окне запуска введите 0 для параметра start, 10 — для finish. Для значения шага (step value) введите 0.5, а для времени установления (settling time) — 200. Затем нажмите save.

Затем снова перейдите в окно масс за одно считывание (masses per reading) и нажмите кнопку воспроизведения. Отметив положение пиков сигналов изотопов, перейдите на вкладку настройки каналов ЦАП (DAC channel setup) в окне настройки прибора. Прокрутите вниз до поля тока (current) и введите значение пика изотопа.

Нажмите «set actual current value», а затем «save». Далее в выпадающем меню выберите «make up gas». Введите 0.55 в поле «start», 0.95 в поле «end», 0.05 в поле «step value» и 200 в поле «settling time».

Нажмите кнопку сохранения. После возвращения в окно масс за одно считывание и повторного нажатия кнопки воспроизведения, на оси x теперь будет отображаться скорость потока газа-добавки. Зафиксируйте значения, при которых сигналы изотопов достигают пика, и обратите внимание на резкое усиление сигнала GD 1 55 ближе к концу.

Затем вернитесь на вкладку настройки канала DAC. Прокрутите вниз до раздела makeup gas и введите новое значение пика изотопа. Нажмите set actual current value.

Затем снова нажмите «Save», чтобы зафиксировать соотношение искомого изотопа и оксида. Сначала выполните вторую инъекцию 450 µL калибровочного раствора. Затем на вкладке параметров (parameter tab) выберите «Time» в раскрывающемся меню и введите 0 в окне начала (start), 10 в окне окончания (end), 1 в окне значения шага (step value) и 200 в окне времени установления (settling window).

После нажатия кнопки воспроизведения в окне масс за одно считывание используйте курсор, чтобы считать более высокое значение для TM 1 69 или TB 1 59, а также значение GD 1 55. Теперь введите три миллилитра воды Milli Q через петлю для пробы, а затем 500 µL промывочного раствора DVS. На вкладке калибровки масс нажмите «Запуск» (run), чтобы контролировать процесс промывки до тех пор, пока интенсивность полос не начнет снижаться.

Затем добавьте 3 мл воды из милли-куба и наблюдайте до тех пор, пока уровень полос не снизится до фоновых значений. Начните с ввода изотопов образца, продемонстрированных ранее, в поля для изотопов калибровочного раствора, после чего нажмите кнопку сохранения. Далее откройте окно сбора данных и при необходимости измените настройки сбора в соответствии с объемом образца.

Например, образец объемом 450 µL заполнит петлю для образца, а время анализа составит 600 секунд, чтобы учесть задержки при сборе данных о клетках. Перед запуском установите задержку сбора данных (acquisition delay) не менее чем на 30 секунд, а задержку стабилизации детектора (detector stability delay) — не менее чем на 20 секунд. Промойте образцы клеток не менее двух раз водой Milli-Q, затем ресуспендируйте образец до максимальной концентрации 10⁶ клеток/мл и профильтруйте полученную клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 35 µm.

Для удаления всех агрегатов. Теперь введите новое имя файла для текущего образца. Обратите внимание, что все файлы должны быть сохранены на диске E.

Затем переведите клапан петли пробоотборника в положение загрузки (load), введите пробу, переведите клапан петли пробоотборника обратно в положение ввода (inject) и нажмите кнопку запуска (run). В окне сбора данных клетки будут представлены в окне моментального снимка в виде горизонтальных групп меток в каждом вертикальном изотопном канале; при этом наилучшее разрешение, как показано здесь, достигается при скорости потока от 300 до 500 клеток в секунду.

После завершения сбора данных образца появится всплывающее окно. Нажмите «ОК», чтобы подтвердить окончание анализа образца, а затем введите не менее 500 µL воды MQ между каждым образцом, чтобы минимизировать перенос пробы и очистить прибор. После использования введите 450 µL промывочного раствора в петлю для проб. Контролируйте высвобождение свободного металла, затем промойте петлю для проб тремя миллилитрами воды milli Q, продолжая промывку до достижения фонового уровня сигнала.

Затем для выключения прибора перейдите на вкладку контроллера RFG в окне настройки прибора и нажмите кнопку «stop plasma» (остановить плазму). По завершении процедуры нажмите «okay» в появившемся окне, в котором рекомендуется извлечь распылитель через вкладку «card cage». Выключите нагреватель, закройте вентиль подачи аргона, а затем осторожно потяните распылитель на себя, чтобы извлечь его из распылительной камеры.

Затем открутите трубку ввода пробы и отложите ее в сторону. Открутите соединение ввода вспомогательного газа до легкого ослабления, после чего снимите распылитель. В завершение, используя тот же шприц и трубку, что были продемонстрированы ранее, промойте оба порта распылителя 5% раствором Citron и храните распылитель, погруженным в 5% раствор Citron, до следующего использования.

Тщательная промывка масс-цитометра деионизированной водой и промывочным раствором DVS снижает уровень абсорбции металлов трубками и другими частями прибора, что помогает уменьшить фоновый сигнал, отображенный на данных графиках. Неправильная настройка, представленная пурпурной линией, привела к значительному увеличению образования оксидов при m плюс 16 по сравнению с правильно настроенным образцом, который показан темно-синей линией. Это приводит к незначительному снижению искомых сигналов при m и значительному увеличению нежелательных фоновых помех при m плюс 16.

Правильная промывка и надлежащее разведение образцов в воде Milli Q обеспечат минимальный фоновый сигнал и максимальное разрешение клеток при соблюдении необходимой скорости анализа. Аналогично данным репрезентативного эксперимента, представленным здесь, в данном эксперименте в режиме сбора данных о клетках были проанализированы полистирольные микросферы, содержащие природное содержание lanthanum 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 и LUTETIUM 1 75. Данные анализировались с помощью FlowJo, а фрагменты разрушенных микросфер были исключены с помощью гейтирования.

Было определено, что оптимально настроенный образец соответствует скорости потока 0,74 liters per minute, что представлено темно-синей линией. При этой скорости потока наблюдалась более высокая интенсивность сигнала, чем при более низких скоростях потока; также было отмечено, что у этого оптимально настроенного образца сигнал на массах металлов M выше, а сигнал на массах оксидов m плюс 16 ниже, чем у неправильно настроенных сигналов. Здесь показан увеличенный фрагмент сигнала на массах M LANTHANUM 1 39 и THULIUM 1 69.

Обратите внимание, что скорость потока газа-носителя влияет на интенсивность сигнала LANTHANUM 1 39 сильнее, чем на интенсивность сигнала thulium 1 69. На данных графиках показаны сигналы при массах оксидов m плюс 16, равных 1 55 и 180 5, что соответствует оксидам LANTHANUM 1 39 плюс oh 16 и thulium 1 69 плюс oh 16 соответственно. Заметьте, что скорость потока газа-носителя увеличивает сигнал массы 1 55 значительно сильнее, чем сигнал массы 180 5, так как lanthanum 1 39 окисляется легче, чем thulium 1 69.

Здесь представлены интенсивности сигналов m и m плюс 16 в зависимости от скорости потока газа-носителя. Закрашенные значки обозначают массу M, в то время как незакрашенные значки представляют массу M плюс 16; цвета линий соответствуют соответствующей массе M. Обратите внимание, что интенсивности сигналов LANTHANUM 1 39 и price ODIUM 1 41 сильно зависят от скорости потока газа-носителя, вплоть до достижения точки, когда количество оксида массы m плюс 16 превышает количество массы M. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как правильно запускать CyTOF, настраивать его, проводить анализ образцов и, наконец, надлежащим образом очищать и выключать прибор по завершении ежедневных сессий.