Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Общая цель этой процедуры заключается в проведении метода на основе ПЦР для количественной оценки приживления донорских клеток в конкурентной модели трансплантации костного мозга мышей, что достигается путем предварительного выполнения трансплантации костного мозга у самок мышей-реципиентов с использованием мужских донорских клеток. Затем берется периферическая кровь у мышей-реципиентов в разные моменты времени, и геномная ДНК изолируется. Образцы подготавливаются к стандартной кривой.

Наконец, проводится ПЦР в реальном времени со стандартными образцами и тестовыми образцами. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают приживление мужских донорских клеток у самок мышей-реципиентов путем расчета по стандартной кривой с известным процентным соотношением мужской и женской ДНК. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующим методом, таким как метод на основе проточной цитометрии, заключается в том, что он более чувствителен, более экономичен, а образцы могут храниться в течение длительного времени.

Самое главное, что наша методика наиболее независима от нитей и может быть использована для любого геномного фона мышей, например, четко определенный маркер клеточной поверхности для дифференциации донорской клетки от клеток реципиента После эвтаназии FVB nj, самцы донорских мышей и самки мышей под ламинарным проточным капюшоном используют небольшие ножницы и щипцы для рассечения бедренной и большеберцовой костей и помещают их в 60-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую шесть миллилитров ледяного льда RPMI 1640 с 5% термоинактивацией. FBS используйте салфетку Кима для удаления мышц и других тканей и отрежьте оба конца каждого костного стержня в блюде. Затем соедините концы костей с иглой 23 калибра, прикрепленной к трехкубовому шприцу, наполненному RPMI 1640 с 5% инактивированным теплом FBS, и промойте костный мозг.

Используйте ту же иглу для дезагрегации ткани костного мозга путем повторных аспираций. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и вращайте ее в течение пяти минут при давлении 400 G. После удаления суперната повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре комнатной температуры, лизируйте эритроциты, буферизируйте и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем добавить от пяти до 10 миллилитров RPMI 1640 с 5% инактивированным теплом FBS. Пропустите клетки через клеточный фильтр и соберите поток в новый тюбик. После раскручивания клеток в течение пяти минут при 400 G и удаления надосадочной жидкости в грануле должно отсутствовать красного цвета, указывающего на полное удаление эритроцитов, ресуспендированных в 10 миллилитрах RPMI 1640 с 5% термоинактивированным FBS, после осторожного вортекса добавить небольшую аликвоту в гемоцитометр и подсчитать клетки.

Рассчитайте объем клеток, необходимый для смешивания с конкурирующими женскими клетками в соотношении пять к двум для трансплантации костного мозга. В качестве заключительного этапа подготовки клеток к инъекции смешайте донорские и конкурирующие клетки, промойте клетки PBS и повторно суспендируйте в PBS в конечной концентрации от пяти до 10 до шестой на миллилитр донорских клеток и от двух умно-10 до шестой на миллилитр для конкурирующих клеток, за четыре-шесть часов до трансплантации костного мозга. Облучайте самок мышей-реципиентов гамма-излучением цезия 1:37 при однократной дозе 11 грей.

Поместите облученных самок мышей в удерживающее устройство для мышей и введите смешанные донорские и конкурирующие клетки через хвостовую вену в общем объеме 0,1 миллилитра таким образом, чтобы каждая мышь получила пять раз по 10 к пятой донорской клетке и два раза по 10 к пятой конкурирующей клетке костного мозга для забора образцов крови. После анестезии мыши собирают около 50 микролитров крови в пробирки, покрытые покрытием ЭДТА, путем ретроорбитального кровотечения. Также соберите образцы у самцов и самок мышей соответствующего возраста.

Далее следует выделить геномную ДНК от испытуемых мышей и мышей. Для получения стандартной кривой добавьте около 200 микролитров буфера для лизиса эритроцитов комнатной температуры в каждый образец крови и инкубируйте в течение пяти минут. Добавьте один миллилитр PBS и уменьшите вращение, чтобы удалить большую часть лизированных эритроцитов.

Затем используйте набор для экстракции ДНК крови, чтобы изолировать ДНК, предварительно нагревая элюцианский буфер до 37 градусов Цельсия. Чтобы увеличить выход, измерьте концентрацию ДНК в каждом образце. Для дальнейшего анализа используются приборы с соотношением ОР два 60 к двум 80 от 1,8 до 2,0.

Чтобы создать стандартную кривую, разбавьте мужскую и женскую ДНК до концентрации четырех нанограммов на микролитр и приготовьте смесь ДНК в соответствии с этими рекомендациями. Настройте реакционную пластину для ПЦР, смешав реагент cyber green super mix с показанными здесь праймерами и геномной ДНК. Каждая реакция объемом 20 микролитров содержит 400 наномоляров каждого праймера и пять микролитров геномной ДНК клеток крови в трех экземплярах.

Проведите ПЦР в соответствии с условиями, найденными в текстовом протоколе, и получите пороговые значения цикла или КТ. Вычислите дельта-КТ, умноженную на величину СТ в степени ZY, один минус СТ в степень BCL два и ЗY один уровень экспрессии или два в степень минус дельта-КТ, получите стандартные кривые, построив график среднего значения тройного двойки в степени дельта СТ до известного процента мужской ДНК в смеси с показанной линейной регрессионной аппроксимацией. Вот примеры стандартных кривых, построенных со средними значениями двух в степени дельта КТ в процентном соотношении мужской ДНК.

Этот график включает в себя удельную температуру плавления для ампликонов BCL two и ZFY one, локализованных на уровне 78,5 и 88,5 градусов Цельсия соответственно. BCL 2 используется в качестве референсного гена для нормализации общего количества загруженной ДНК в каждой ПЦР-реакции. Две кривые амплификации BCL для каждого стандартного образца сливаются друг с другом независимо от концентрации мужской ДНК, указывая на равное количество загруженной ДНК.

Тем не менее, кривые амплификации ZFY one, мигрировавшие влево с увеличением количества мужской ДНК в образце гемопоэтических стволовых клеток от мышей PIM TKO, имеют дефекты в восстановлении смертельно облученных мышей, и, как и ожидалось, у мышей-реципиентов, которым трансплантировали клетки PIM TKO, процент мужских клеток был значительно ниже по сравнению с мышами, которым трансплантировали клетки дикого типа. Чтобы проверить наш метод, мы протестировали приживление мужских донорских клеток у трансплантированных самок мышей, получающих клетки костного мозга от мышей дикого типа в сравнении с PIM triple knockout или TKO в разные моменты времени после трансплантации, как периферическую кровь через шесть недель, так и образцы костного мозга через 16 недель. Были проанализированы после просмотра данного видео.

Вы должны хорошо понимать, как использовать метод на основе ПЦР для количественной оценки приживления донорских клеток в конкурентной модели трансплантации морского костного мозга.