Определение микробной внеклеточной ферментативной активности в вод, почв и донных отложений с использованием высокой пропускной MICROPLATE Анализы

Общая цель данной процедуры заключается в быстром анализе активности микробных внеклеточных ферментов в различных природных средах. Это достигается путем добавления образцов воды или почвенных суспензий в микропланшет для получения адекватной репликации В качестве второго шага в лунки микропланшетов добавляется искусственный колорметрический или флюорометрический субстрат, что позволяет проводить ферментативные реакции. Затем измеряется либо абсорбция, либо флуоресценция, чтобы определить количество конечного продукта, выделяющегося во время реакции.

Результаты показывают различия в активности внеклеточных ферментов между образцами на основе поглощения или флуоресценции конечной реакции. Сегодня мы покажем, как измерить активность внеклеточных ферментов в естественной среде. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы микробной экологии, такие как скорость обработки органических веществ в воде и минерализация питательных веществ в почве, отложениях и водах.

Визуальная демонстрация этой процедуры имеет решающее значение, поскольку компоновка пластин может быть сложной для освоения, а проведение измерений с несколькими временными шагами может сделать эту процедуру более сложной. Холометрический анализ активности внеклеточных ферментов для почв и отложений начинается с приготовления субстрата буфера и стандартных растворов, описанных в текстовом протоколе для почвы, подготовки суспензии каждого образца для анализа в стерильной центрифужной пробирке объемом 15 миллилитров. Добавьте концентрацию примерно один грамм на миллилитр, используя 50 миллимолярный ацетатный буфер для отложений.

Добавьте достаточное количество ацетатного буфера, чтобы суспензия легко вытекала. Точный объем необходимой суспензии будет варьироваться в зависимости от количества анализируемых ферментов, но рекомендуется минимум пять миллилитров. Перемешивайте каждую кашу до тех пор, пока все комки почвы или осадка не разойдутся.

И обратите внимание на итоговый объем. Перед пипетированием зафиксируйте концы наконечников пипеток ножницами. Поскольку почвенные шламы имеют тенденцию засорять кончики, переделайте каждый шлам и немедленно влейте 150 микролитров в каждую из шести лунок.

На блоке скважин глубиной 96 скважин. Важно проводить вихрь тщательно и часто. Чтобы частицы почвы оставались во взвешенном состоянии, оставляйте пустыми не менее двух лунок на блок, которые будут служить в качестве контроля субстрата.

Подготовка 1 96. Хорошо заблокируйте для каждого фермента анализ. Налейте примерно пять миллилитров ацетатного буфера в резервуар для пипетки и с помощью восьмиканального пипеттера добавьте 150 микролитров буфера в последние две лунки каждого образца.

Для образца буфер управления и до двух контрольных лунок подложки. Налейте приблизительно 10 миллилитров соответствующего раствора нитрофенхеля или субстрата PNP в резервуар для пипетки и с помощью восьмиканального пипеттера добавьте 150 микролитров раствора субстрата в первые четыре лунки каждого образца и в две контрольные лунки для субстрата. Обратите внимание на время, по которому начинается реакция, как только будет добавлен раствор субстрата.

Инкубируйте планшеты при комнатной температуре от 0,5 до четырех часов. Точное время инкубации будет варьироваться в зависимости от уровня активности в образцах и фермента, который будет проанализирован. Пока анализы инкубируются, подготовьте одну прозрачную 96 лунку микропланшета.

Для каждой глубокой лунки блокируют для того, чтобы считать абсорбционную пипетку, в каждую лунку микропланшета вносится 190 микролитров дистиллированной воды и 10 микролитров одного молярного гидроксида натрия. Гидроксид натрия замедляет ферментативную реакцию и повышает pH, что усиливает цвет PNP, выделяемого в ходе реакции после инкубации. Центрифугируйте 96 луночных блоков при температуре от 2000 до 5 000 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать частицы почвы.

Удаление жидкости без повреждения гранул может быть сложной задачей. Следует избегать использования слишком большого количества образца почвы на начальном этапе. Обязательно центрифугируйте достаточно долго и используйте осторожные, но уверенные движения, чтобы удалить жидкость.

Используйте многоканальную пипетку, чтобы извлечь по 100 микролитров из каждой. Хорошо соблюдайте осторожность, чтобы не допустить попадания гранул. Переведите жидкость в соответствующую лунку на подготовленный прозрачный 96-луночный микропланшет, включите считыватель Microplate и настройте все необходимое программное обеспечение для записи поглощения на 410 нанометров после определения сухой массы образцов, как описано в текстовом протоколе, рассчитайте окончательную абсорбцию каждого образца путем вычитания контрольной абсорбции образца из абсорбции образца.

Если контрольные элементы подложки имеют высокую поглощающую способность более 0,060, то вычтите их. Также приступаем к расчету активности фермента в микромолях в час на грамм сухой массы с помощью этого уравнения. После организации черной микропластины для каждого фермента в соответствии с примером, показанным в текстовом протоколе, налейте примерно пять миллилитров первой пробы воды в резервуар для пипетки и с помощью восьмиканального пипеттера нанесите 200 микролитров во все лунки.

В первой колонке микропланшета выбросьте использованные наконечники для пипеток и повторите по мере необходимости для каждой пробы воды, чтобы заполнить колонки с первой по девятую. Настройте элементы управления для учета образцов, стандартов, подложки и закалки на той же черной микропластине, что и образцы. Контрольные образцы содержат воду для проб и буфер бикарбоната и не используются в расчетах активности, но демонстрируют постоянство показаний на протяжении всего эксперимента.

Регуляторы гашения состоят из образца воды и стандартного количества флуоресцентной метки и используются для измерения дифракции флуоресценции. В образце воды субстрат и стандартные элементы управления состоят либо из субстрата, либо из стандартной флуоресцентной метки соответственно и бикарбонатного буфера. Налейте примерно пять миллилитров пятимиллиметрового бикарбонатного буфера в чистый резервуар для пипетки.

Пипетка 50 микролитров буфера в микропланшетные лунки с 1 по 9 в рядах d и e для формирования двух, повторите лунки контрольных образцов для каждой пробы, замените наконечники пипетки, затем перенесите 200 микролитров буфера бикарбоната в лунки с 10 по 12 в рядах A и H. Хотя свет в этой демонстрации остается ярким для целей киносъемки, Окружающее освещение следует уменьшать путем уменьшения яркости или выключения света, так как стандарт флуоресцентной лампы является светочувствительным. Налейте приблизительно пять миллилитров 10 микромоляров, четыре метилмоляра или MUB в чистый резервуар для пипетки, пипетку 50 микролитров в лунки с одной по 12 в ряду H. Затем пипетку по 50 микролитров в лунки с первой по девятую в рядах G и F, чтобы сформировать три репликации контроля закалки на образец и общий стандартный контроль. Либо поместите микропланшет в темноту, либо накройте непрозрачной крышкой, чтобы уменьшить светодеградацию MUB, включите флуориметр и настройте все необходимое программное обеспечение, чтобы оно было готово к чтению перед добавлением подложки.

Для подачи приблизительно пяти миллилитров соответствующего субстрата, выстланного MUB, в чистый резервуар для пипетки используйте 12-канальный пипеттер для дозирования 50 микролитров в лунки с 1 по 12 в ряду А и в лунки с 1 по 9 в рядах В и С для формирования трех повторных анализов для каждого образца, и три контрольных субстрата немедленно приступают к регистрации флуоресценции. Считывание исходной флуоресценции сразу после добавления подложки в микропланшет после считывания. Флуоресцентные инкубируют микропланшет при комнатной температуре либо в темноте, либо накрыв непрозрачной крышкой.

Для уменьшения световой деградации MUB. Время инкубации, необходимое для измерения максимальной потенциальной активности фермента, будет зависеть от концентрации фермента в образце. Поскольку это неизвестно, перед анализом образца микропланшет должен быть считан с несколькими этапами.

Для большинства ферментов подходят интервалы от 10 до 15 минут в течение часа, хотя некоторые образцы с высокой концентрацией достигают пика до 10 минут. Продолжайте считывать флуоресценцию в микропланшете с назначенными интервалами не менее часа. Обязательно держите микропланшет закрытым или в темноте между показаниями.

Для каждого образца в каждом интервале времени рассчитайте среднюю флуоресценцию исходного образца, среднюю флуоресценцию конечного образца, среднюю стандартную флуоресценцию и среднее контролируемое флуоресценцию гашения для каждого интервала времени. Рассчитайте активность фермента в м в час на миллилитр. Используя уравнение, найденное в текстовом протоколе.

Изучите значения активности, рассчитанные для каждого временного шага, определите конечную потенциальную активность на временном шаге с наибольшей активностью. Если значения активности продолжают расти, то могут потребоваться более поздние временные шаги. Если значения активности падают в течение всего забега, то выполните повторное выполнение с более короткими временными шагами.

Почвы и водные отложения обычно имеют заметные уровни внеклеточной активности ферментов в результате роста прикрепленных микробных сообществ на поверхности частиц. На этом рисунке показано, как эта активность изменяется в зависимости от размера частиц, полученных из поверхностных отложений ручья третьего порядка в северной части Миссисипи. Предыдущее исследование USAA показало, что бактериальные сообщества на частицах отложений из этого потока могут быть разделены на три отдельные группы на основе молекулярного анализа структуры их сообществ.

Частицы размером 0,063 миллиметра, частицы размером 0,1, 2, 5, 0, 0,25 и 0,5 миллиметра, а также частицы размером 1 миллиметр. Анализ паттернов внеклеточной активности ферментов подтверждает этот вывод, при этом фосфатаза одинакова для частиц размером 0,1, 2, 5, 0, 0,25 и 0,5 мм, но значительно выше для фракций 1 и 0,063 мм при измерении с использованием метода PNP-связанного субстрата. Другие ферменты, такие как бета-глюкко и n AGAs, демонстрируют аналогичные пики на мельчайших частицах, но не повышены на одном миллиметре частиц

Подчеркивается тот факт, что различные ферменты могут демонстрировать различное распределение в окружающей среде, и это может быть выяснено с помощью этого анализа. Относительно низкие погрешности показывают, что холометрические анализы активности ферментов в отложениях воспроизводимы и, таким образом, поддаются статистическому анализу. При сравнении различных образцов и образцов окружающей среды, природные воды, как правило, имеют более низкую активность внеклеточных ферментов на миллилитр, чем почвы или отложения на грамм

Таким образом, их следует измерять флору метрически с использованием субстратов, связанных с MUB. На этом рисунке показано, как активность ферментов, фосфатазы, бета, глюкко и NGA изменяется с глубиной. Известно, что в мелководном озере на севере штата Миссисипи, США, оно бедно питательными веществами, что также объясняется относительно высокой активностью фосфатазы и фермента, которые микроорганизмы производят для получения фосфатов из органических соединений.

Для всех трех ферментов пробы, собранные на поверхности воды и на глубине 50 сантиметров, показали аналогичную активность. В то время как активность в 100-сантиметровом образце была повышена, образец был в основном взят из раздела водных отложений, и присутствие частиц осадка в образце, вероятно, объясняет более высокую активность, наблюдаемую в образце, особенно в отношении бета-глюкко и n AGA. Как и в случае с субстратами PNP, низкие погрешности показывают, что даже при наличии всего трех повторных показаний воспроизводимость флюорометрических анализов с использованием субстратов MUB высока.

Обратите внимание, что единицы активности фермента в пробе воды относятся к потребляемому субстрату, тогда как единицы активности фермента к частицам осадка находятся в микромолях потребляемого субстрата, даже если размер на единицу сопоставим. Это подчеркивает тот факт, что почвы и отложения, как правило, имеют гораздо более высокую внеклеточную активность, чем природные воды. Это также демонстрирует повышенную чувствительность метода MUB-связанного субстрата и необходимость использования этого метода для анализа активности внеклеточных ферментов в образцах воды после освоения.

Этот метод может быть использован для анализа девяти проб воды на содержание ферментов всего за час При попытке выполнить эту процедуру для почвы и отложений. Важно использовать известный массивный материал, чтобы активность могла быть выражена на основе сухого веса. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерять активность внеклеточных ферментов и различных природных сред с помощью методов цветовой или более низкой метрической метрики.