Генерация сдвига адгезии карте с помощью SynVivo Синтетический микрососудистых сетей

Общей целью данного эксперимента является получение чистой карты адгезии клеточных частиц из одного эксперимента с использованием синтетических микрососудистых сетей. Это достигается путем предварительного покрытия микрофлюидного устройства интересующим белком, в данном случае авадоном. На втором этапе биотинилированные частицы впрыскиваются в устройство со скоростью физиологического сдвига, которая связывается с устройством с авадонным покрытием с дифференциальными структурами в зависимости от локальной скорости сдвига.

Затем подсчитывается количество связанных частиц, чтобы создать карту чистой адгезии частиц с использованием созданной вычислительно созданной базы данных значений чистой скорости в сети. Результаты показывают, что в результате одного эксперимента можно получить полную карту адгезии, что приводит к значительной экономии времени и реагентов по сравнению с обычными проточными камерами с параллельными пластинами. Основное преимущество этой технологии по сравнению с существующими методами, такими как линейные каналы потока, заключается в том, что мы можем создавать общие карты на основе одного эксперимента, что приводит к значительной экономии средств и времени.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области доставки лекарств, такие как способность средств доставки лекарств связываться с желаемыми мишенями. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы использовали проточные камеры с лопастными пластинами для понимания конкретных поражений клеток. Однако в условиях жидкости основное внимание в этом анализе уделяется получению базового представления об адгезии частиц и клеток.

Платформа syn vivo может быть применена к множеству других систем, таких как рак и доставка ЦНС, инфекции и воспаления, тромбоз и дисфункция микроциркуляции. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы работы микрофлюидных устройств сложны для освоения, так как необходимо привыкнуть к небольшим объемам образцов, а передовые методы предотвращения образования пузырьков лучше передаются визуально. Демонстрировать процедуру будет Эшли Смит, научный сотрудник нашей лаборатории.

Микрофлюидное устройство SynVivo SMN состоит из двух наборов параллельных портов, один из которых предназначен для поверхностного покрытия, фрагментов и/или ячеек для сидения, а другой — для проведения анализа. Для начала полностью погрузите прибор в чашку Петри, содержащую стерильную деионизированную воду, и поместите чашку в вакуум. Осушите дайте влагопоглотителю работать до тех пор, пока весь воздух не будет удален из каналов устройства.

Это должно занять примерно 15 минут, прежде чем вытащить устройство из воды. С помощью тонкоточечных щипцов поместите заправленные водой трубки тигон в каждое отверстие устройства. Трубка должна быть примерно один дюйм в длину.

Теперь устройство можно извлечь из воды с помощью пипетки или шприца. Поместите каплю воды вокруг основания одной трубки впускного отверстия. Осторожно снимите трубку.

Капля воды предотвратит попадание воздуха внутрь устройства. Далее приготовьте одномиллилитровый шприц, загруженный авадоном в концентрации 20 микрограмм на миллилитр. Подсоедините шприц к игле из нержавеющей стали 24 калибра и трубке Зажимите входной порт не используется с помощью зажима для губок.

Вставьте трубку во впускное отверстие устройства. Вводите авадон со скоростью потока один микролитр в минуту в течение 10 минут, чтобы обеспечить полную перфузию устройства. По окончанию времени потока.

Зажмите все трубки кулачковыми зажимами и поместите устройство при температуре четыре градуса на ночь. Дайте устройству нагреться до комнатной температуры. Затем поместите устройство на инвертированный флуоресцентный микроскоп, оснащенный моторизованным столиком и высокопроизводительной камерой.

Приготовьте раствор биотинилированных частиц размером два микрона в концентрации 5 миллионов частиц на миллилитр в фосфатно-солевом буфере или PBS. Загрузите частицы в одномиллилитровый шприц. Приготовьте второй одномиллилитровый шприц PBS.

Загрузите каждый шприц только в шприцевой насос, а затем подсоедините их к игле и трубке с помощью шприца-пипетки. Поместите каплю воды вокруг основания трубки впускного отверстия и осторожно удалите трубку, используемую для покрытия устройства. Осторожно вставьте трубки для биотинилированных частиц и для PBS в каждый из входных отверстий.

Затем начните впрыскивать биотинилированные частицы со скоростью потока 2,5 микролитра в минуту. Следите за входным отверстием на микроскопе при первых признаках появления частиц. Запустите таймер и продолжайте подачу в течение трех минут.

По истечении трех минут остановите поток биотинилированных частиц, одновременно запуская поток PBS со скоростью потока 2,5 микролитра в минуту. Дайте PBS протечь в устройстве в течение трех минут, чтобы смыть несвязанные частицы. Чтобы начать сканирование, используйте функцию сканирования больших изображений в программном обеспечении для получения изображения всего устройства, затем последовательно пронумеруйте бифуркации в устройстве и создайте круглую область интереса с удвоенным диаметром каналов.

В этом случае установите диаметр интересующей области равным 200 мкм, так как диаметр канала равен 100 мкм. Используйте функцию автоматического подсчета в программном обеспечении для обработки изображений, чтобы экспортировать количество частиц в каждой интересующей области в электронную таблицу. Кроме того, используйте функцию автоматической учетной записи для экспорта количества частиц во всем устройстве.

Выполняется CFD-моделирование, результаты которого сохраняются в базе данных для дальнейшего анализа. Информация, включенная в результаты, содержит скорость сдвига стенки, скорость потока частиц и прилегание к устройству. Приведенная здесь информация используется для определения количества частиц, которые прилипают к каждой области интереса при определенном входе концентрации частиц.

Чтобы создать карту адгезии при сдвиге, рассчитайте процент адгезии, как указано в текстовом протоколе, в качестве последнего шага. Постройте карту чистой адгезии, используя чистую скорость при каждой бифуркации сетей и процентные значения адгезии. На этом изображении показано типичное устройство syn vivo SMN с покрытием avidan после связывания двух микронных биотинилированных частиц.

Обратите внимание, что частицы преимущественно прилипают вблизи бифуркаций в сети. Пронумерованные бифуркации в сети syn vivo SMN можно увидеть здесь. Это изображение представляет собой образец карты сдвига стены, созданной с помощью модели вычислительной гидродинамики устройства.

Скорость сдвига в устройстве варьируется от 250 до 15 обратных секунд, как это наблюдается в микрососудистой сети in vivo. Обратите внимание, что эти различные скорости сдвига не могут быть получены одновременно в линейных микрофлюидных каналах, поскольку они обеспечивают постоянную скорость сдвига для каждой скорости потока. Показанный здесь график значений скорости сдвига в каждой из бифуркаций сети показывает, что модели скорости сдвига сложны и не могут быть получены с помощью простой аналитической зависимости, в отличие от линейных каналов потока.

Более того, в сети присутствуют множественные бифуркации, которые попадают в одну и ту же чистую корзину. Повышение статистической достоверности отображаемых данных. Ниже приведены примеры результатов анализа вычислительной гидродинамики потоков частиц в сети, которые используются для вычисления потоков частиц в ветвях и бифуркациях экспериментальной сети.

Карта чистой адгезии, вычисленная из одного эксперимента syn vivo SMN, следует обратной зависимости, наблюдаемой по картам чистой адгезии, полученным в экспериментах с линейным каналом. Тем не менее, используя анализ SynVivo, один эксперимент позволяет создать эту чистую карту, в то время как несколько экспериментальных прогонов получают из линейных каналов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать устройства SynVivo SMN для создания общей адгезии на основе одного эксперимента.

При проведении этого эксперимента важно помнить, что нельзя вводить пузырьки в микрофлюидное устройство SynVivo SMN после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области воспаления к изучению взаимодействия эндотелия лейкоцитов с разной скоростью в одном эксперименте. В следующем поколении устройств исследователи могут изучать адгезию и миграцию лейкоцитов за один анализ, что в настоящее время невозможно.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы исследования адгезии лекарственных средств, средств доставки лекарств и клеток для изучения таких вопросов, как физиологическое влияние потока на клеточную клетку, клеточный лекарственный препарат и адгезия лекарственного средства.