Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

Общая цель данной процедуры заключается в получении инфекционных вирусных частиц, полностью синтезированных из клонированной кДНК РНК-вирусов положительной полярности, чьи геномы имеют ту же полярность, что и клеточная мРНК, например, вируса японского энцефалита. Данный метод обратной генетики на основе кДНК является основополагающим подходом, который позволяет напрямую манипулировать вирусной геномной РНК, создавая тем самым рекомбинантные вирусы для молекулярных и генетических исследований репликации и патогенеза вирусов. Эта методика также представляет собой ценную платформу, позволяющую разрабатывать генетически определенные вирусные векторы на основе вируса вакцинии для доставки чужеродных генов.

Данные методы применимы для клонирования полноразмерных кДНК негативных или позитивных штаммов, РНК-вирусов, особенно тех, чей геном превышает 10 kb. Процедуру продемонстрируют сотрудники моей лаборатории: лаборант Сан-Им Юн, постдоки Бён-Хак Сон и Джин-Кён Ким, а также студент бакалавриата Джордан Фрэнк.

Видеочасть данной публикации охватывает подготовку бактериальной искусственной хромосомы, содержащей интересующие последовательности, синтез РНК, транскрибируемой с обратной плазмиды, а также методы измерения инфекционности РНК и выхода вируса. Все процедуры, предшествующие созданию плазмиды BAC, подробно описаны в текстовом протоколе. Для данной процедуры сначала вырастите одну колонию E. coli DH10B, несущую плазмиду BAC, в трех миллилитрах бульона 2X YT с хлорамфениколом. Инкубируйте культуру в течение 10 часов при 35 °C с перемешиванием при 225–250 RPM.

Через 10 часов увеличьте объем культуры. Затем инокулируйте 500 µL культуры в 500 мл среды и культивируйте инокулят в течение шести часов при интенсивном перемешивании. Через шесть часов центрифугируйте бактериальную культуру в двух флаконах объемом 250 мл при 3 100 g в течение 15 минут при температуре 4 °C. Затем ресуспендируйте каждый осадок в 30 мл раствора GTE.

Добавьте 500 µL лизоцима и инкубируйте суспензии на льду в течение 10 минут. Тем временем приготовьте свежий лизирующий раствор для следующего этапа. Через 10 минут добавьте 60 mL лизирующего раствора и перемешайте круговыми движениями до полного осветления раствора.

Проводите реакции при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте по 45 миллилитров нейтрализующего раствора в каждый флакон и перемешайте содержимое путем переворачивания флаконов до достижения полной однородности. После этого поместите их на лед на 10 минут.

Соберите нейтрализованные лизаты с помощью центрифугирования при высоких g в охлаждаемой центрифуге. Затем перенесите супернатанты в две новые бутыли объемом 250 мл. Добавьте в каждую из них 0,6 объема 100% изопропанола и выдержите на льду в течение 20 минут.

Затем центрифугируйте осадки, после чего удалите супернатанты и растворите пеллеты в пяти миллилитрах ТЕ-буфера. Объедините оба объема в одной пробирке емкостью 50 миллилитров и осадите РНК, добавив равный объем 5 M хлорида лития и инкубируя смесь на льду в течение 10 минут. Для сбора осадка РНК проведите холодное центрифугирование в течение 20 минут.

Затем перенесите супернатант в новую пробирку объемом 250 миллилитров, добавьте два объема 100% изопропанола и поместите пробирку на лед для осаждения ДНК. Через 20 минут центрифугируйте пробирку для осаждения, удалите супернатант путем аспирации, ресуспендируйте осадок ДНК в 9,5 миллилитрах ТЕ-буфера и перенесите раствор ДНК в пробирку объемом 50 миллилитров.

Продолжите подготовку, создав градиент хлорида цезия с этидиумбромидом. Перенесите смесь в герметичную полипропиленовую пробирку с помощью шприца с иглой 18 G и запечатайте пробирку. Центрифугируйте запечатанную пробирку в ультрацентрифуге в течение ночи для формирования градиента хлорида цезия.

На следующий день выделите полосу ДНК плазмиды BAC из градиента хлорида цезия. Используйте иглу 18-го калибра, чтобы создать воздушный клапан в верхней части градиента, и иглу 20-го калибра со шприцем для сбора ДНК BAC сбоку градиента, после чего перенесите собранный материал в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра. Выполните промывку: добавьте 2,5 объема насыщенного водой бутанола и перемешайте с помощью обычного вортексирования.

Затем центрифугируйте смесь при комнатной температуре и перенесите нижнюю водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Повторите эту промывку в общей сложности шесть раз, чтобы полностью удалить бромистый этидий. Теперь проведите осаждение ДНК BAC. Добавьте в пробирку 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема 100% этанола. Инкубируйте смесь на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируйте осадок при комнатной температуре и промойте осадок ДНК 1 мл 70% этанола. Повторите центрифугирование и снова соберите осадок. В завершение высушите осадок ДНК на воздухе в течение 10 минут и элюируйте его в 200 µL ТЕ-буфера.

Начните с крупномасштабного рестрикционного расщепления плазмиды BAC ферментом Xba-one в общем объеме 100 µL. Проводите расщепление при 37 °C в течение 12–15 часов. Затем инкубируйте полученную смесь с дополнительными 25 единицами нуклеазы из бобов мунг при 30 °C в течение двух часов.

После инкубации доведите объем до 300 µL дистиллированной водой. Затем проведите экстракцию фенолом: добавьте к разбавленному образцу равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, интенсивно перемешайте на вортексе в течение одной минуты, центрифугируйте пробирку и перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку.

Затем повторите экстракцию хлороформом. Далее выделите линеаризованную ДНК BAC путем осаждения этанолом. Соберите осадок ДНК центрифугированием, удалите супернатант и промойте осадок одним миллилитром 70%этанола. Повторите стадию центрифугирования и высушите осадок на воздухе. После 10 минут сушки растворите осадок ДНК в 30 µL дистиллированной воды. Затем проанализируйте один µL полученной ДНК BAC на 0.8% агарозном геле.

Затем проведите реакцию транскрипции до конца (runoff transcription) линеаризованной ДНК BAC в объеме 25 µL, добавив тритиевый UTP для количественного определения РНК. Проводите реакцию при 37 °C в течение одного часа. После этого проанализируйте один или два µL продукта реакции транскрипции с помощью 0,6% агарозного геля.

Используйте клетки BHK-21, выращенные в течение 24 часов в чашках диаметром 150 мм при плотности посева 3 млн клеток на чашку. Промойте монослой клеток холодным раствором A, затем отделите их путем трипсинизации. Соберите клетки путем центрифугирования при 270 g в течение двух минут.

Затем ресуспендируйте клетки в 50 миллилитрах холодного раствора A и снова центрифугируйте их. Повторите эту процедуру промывки трижды. После последней промывки ресуспендируйте клетки в растворе A до концентрации 20 миллионов на миллилитр. Затем смешайте аликвоту клеточной суспензии объемом 400 микролитров с двумя микрограммами синтетической РНК в кювете с ширию 2 миллиметра.

Незамедлительно проведите электропорацию смеси при оптимальных условиях и оставьте клетки отдохнуть на 10 минут. Затем перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку, содержащую 600 µL полной культурной среды. Теперь приготовьте десятикратные серийные разведения электропорированных клеток в объемах по 1 mL. Высейте аликвоты по 100 µL каждого разведения на монослои нормальных клеток BHK21. После четырех-шести часов инкубации нанесите на клетки слой 0,5% агарозы в MEM с добавлением FBS и культивируйте их еще четыре дня.

Клетки BHK21 подвергали имитации электропорации или электропорировали РНК-транскриптами, полученными из двух независимых клонов полноразмерного JEV-BAC. Через четыре дня клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым для визуализации инфекционной РНК в клетках. С помощью этого окрашивания количественно определяли инфекционные центры. Затем, через 20 часов после трансфекции, в электропорированных РНК клетках исследовали экспрессию вирусного белка с использованием кроличьей антисыворотки к NS-one и конъюгата вторичных антител с Cy3, который виден красным цветом. Ядра подвергали контрастному окрашиванию DAPI, который виден синим цветом. Впоследствии, через 22 и 40 часов после трансфекции, методом анализа бляшек исследовали накопление инфекционных вирионов в супернатантах культур электропорированных РНК клеток.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как полностью восстановить инфекционный вирус из клонированной кДНК положительного штамма РНК, такого как вирус японского энцефалита. Помните, что работа с вирусом японского энцефалита и другими патогенами человека может быть чрезвычайно опасной. Перед выполнением данной процедуры необходимо пройти надлежащий инструктаж по биологической безопасности.