Изображение на основе проточной цитометрии Методика оценки изменений в Гранулоцита функции In Vitro

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы оценить функцию гранулоцитов с помощью двухпараметрического подхода. Это достигается путем первичной инкубации гранулоцитов из образцов крови пациента с биочастицами и реагентом для визуализации окислительного взрыва. На втором этапе постинкубационный фагоцитоз блокируется, а затем рецепторы клеточной поверхности, представляющие интерес, помечаются, чтобы обеспечить положительную идентификацию гранулоцитов.

В конечном счете, активированные субпопуляции гранулоцитов могут быть идентифицированы и выделены с помощью проточной цитометрии на основе изображений. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нутрициологии или клинической иммунологии, например, как пищевые привычки и практика питания способствуют изменениям и функции гранулоцитов. Демонстрировать эту процедуру будет Эрик Прадо, докторант из моей лаборатории.

После получения оттаивания образца периферической крови, биочастиц SIU и DHE при комнатной температуре и маламеда этила в ванне при температуре 37 градусов Цельсия, когда реагенты оттают, добавьте 20 микролитров биочастиц ssus в четыре отдельные пробирки объемом 1,2 миллилитра в стерильном колпаке. Затем добавьте 40 микролитров размороженного DHE в каждую пробирку, содержащую биочастицы, и осторожно постучите по пробиркам на скамейке, чтобы собрать реагент на дне пробирок. После добавления 100 микролитров смешанной цельной крови в каждую пробирку удалите всю загрязняющую кровь вдоль внутреннего края пробирок с помощью аппликатора с ватным наконечником и перемешайте кровь и реагенты с помощью электронного набора пипеток в течение трех циклов.

После третьего цикла поместите все трубки в ведро со льдом, защищенное от света. Затем инкубируйте пробирки в течение 10, 20 или 40 минут в ванне с температурой 37 градусов Цельсия, начиная с 40-минутной пробирки, чтобы убедиться, что все инкубации завершаются одновременно. В конце инкубации выдайте по 15 микролитров этилмаламеда в каждую из пробирок.

Через 30 минут инкубируйте клетки с 10 микролитрами каждого из соответствующих антител. Через час далее инкубируют клетки в 750 микролитрах лейкоцитов, фиксируют раствор эритроцитов от вшей. Еще через час инкубация центрифугирует клетки и вакуумирует надосадочную жидкость, оставляя остаточный объем жидкости в 100 микролитров над клеточной гранулой.

Теперь добавьте в каждую пробу по 10 микролитров свежеразведенных семи А и 50 микролитров PBS и 25 микролитров калибровочных шариков. Затем закройте трубочки крышками, заверните их в фольгу и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Когда проточный цитометр на основе изображений будет готов, запустите каждую пробирку, собирая не менее 3000 событий сайта ULU с использованием заранее определенных параметров для анализа образцов.

Используйте мастер автоматической коррекции программного обеспечения IDEA для применения матрицы компенсации к файлам необработанных изображений и для создания файлов компенсированных изображений. Затем загрузите отдельные файлы CIF в программное обеспечение IDEA и сгенерируйте следующие графики для определения подмножеств гранулоцитов для каждого образца пациента. Используя нестимулированный контроль в качестве эталонного стандарта, сначала используйте гистограмму среднеквадратичного градиента светлого поля, чтобы установить начальные вентили и идентифицировать клетки, которые считались в фокусе.

Затем, чтобы отделить синглетные ячейки от мусора и дублетов, создайте точечную диаграмму соотношения сторон Светлого поля к области светлого поля. После того, как чистая популяция клеток была идентифицирована, установите точечную диаграмму CD 45 в сравнении с CD 66 B.To положительно идентифицировать CD 45 положительные CD 66 B положительные гранулоциты. Наконец, создайте точечную диаграмму интенсивности ярких деталей для золотистого цвета в сравнении с интенсивностью ярких деталей для окислительного взрыва.

Для идентификации подмножеств активированных гранулоцитов, собирающих изображения в светлом поле в каналах 1 и 9, биочастиц в канале 3, DHE в канале 4, 7 a и d в канале 5, CD 66 B в канале 11 и CD 45 в канале 12, также может быть сгенерировано двухцветное наложение, изображающее комбинированные события DHE и биочастиц. С помощью проточной цитометрии на основе изображений однородная популяция активированных гранулоцитов может быть разделена на три различных подмножества активации. При использовании этого метода наиболее эффективным способом определения трех подмножеств является построение графика интенсивности ярких деталей для фагоцитоза в зависимости от окислительного взрыва.

Дальнейшее использование мастера колокализации в программном обеспечении IDEAS позволяет количественно оценить наличие одновременного фагоцитоза и окислительного взрыва гранулоцитов, что является отличительным признаком высокой активации. Кроме того, в этом эксперименте 40-минутный инкубационный период продемонстрировал наибольший процент высокоактивных гранулоцитов. Таким образом, включение в протокол по меньшей мере трех инкубационных периодов облегчает определение того, как данное клиническое лечение может изменить временный статус активации гранулоцитов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как мультиплексные анализы на основе гранул, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, как изменяется продукция хемокина GRANULOCYTE в супинате после воздействия биочастиц?