Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции В Vivo С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Общей целью этой процедуры является оценка фагоцитарной функции микроглии сетчатки in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, например, изменяют ли определенные соединения фагоцитарную функцию микроглии в физиологических условиях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она использует проточную цитометрию, позволяющую быстро и точно провести количественный анализ микроглиального фагоцитоза.

Продемонстрировать процедуру мне будет помогать Сусуму Сакимото, постдок из моей лаборатории. Начните с загрузки иглы и шприца 33-го калибра 0,5 микролитрами раствора флуоресцентно меченых частиц. Затем поместите мышь под наркозом боком на мягкий материал под хирургическим микроскопом и подтвердите соответствующий уровень седации отсутствием реакции на защемление пальца ноги.

Затем с помощью щипцов осторожно надавите на одно веко, чтобы глазное яблоко слегка выскочило из глазницы. Затем возьмитесь за голову двумя пальцами чуть выше уха и за челюсть животного и осторожно растяните кожу параллельно векам, чтобы глаз был слегка выпуклым из глазницы. Интравитреальные инъекции являются сложной задачей, и если их неправильно выполнить, они приведут к смещенным и изменчивым результатам.

Чтобы уменьшить травматизацию глаза, удерживайте животное в устойчивом положении с минимальным движением головы. Чтобы проколоть глазное яблоко, аккуратно возьмитесь за мышь одной рукой. Затем найдите лимб роговицы, где соединяются роговица и склера, который виден в виде серого круга у пигментированных мышей.

Держа шприц в другой руке, введите иглу в лимб. Затем слегка втяните иглу, чтобы вытолкнуть небольшой объем стекловидной жидкости, и медленно нажмите на поршень, чтобы ввести частицы. Когда все шарики будут доставлены, медленно извлеките шприц, чтобы избежать рефлюкса введенного материала, и нанесите увлажняющие капли, чтобы сохранить глаз увлажненным, как только глаз вернется на место.

Затем поместите животное на грелку в собственную клетку с наблюдением до полного выздоровления. Через три часа после интравитреальной инъекции используйте щипцы под углом 45 градусов, чтобы мягко надавить на веко, чтобы проптоизировать глазное яблоко. Расположите щипцы за глазным яблоком и потяните.

Затем перенесите глазное яблоко в сухую область чашки Петри, содержащую небольшой объем PBS с кальцием и магнием под препарирующим микроскопом. И используйте один кончик сверхтонких щипцов, чтобы перфорировать глаз в роговичном лимбе. Затем, удерживая глазное яблоко тонкими щипцами под углом 45 градусов, используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать вокруг лимба роговицы, пока не будет разрезана примерно половина окружности.

Перенесите глазное яблоко в PBS и используйте вторую пару тонких щипцов под углом 45 градусов, чтобы разорвать роговицу и склеру на части. Хрусталик и сетчатка кожи выйдут неповрежденными. Убедитесь, что хрусталик и сетчатка отделены друг от друга, и перенесите сетчатку в полистирольную пробирку объемом 5,4 миллилитра, содержащую два миллилитра PBS с кальцием и магнием.

Чтобы получить одноклеточную суспензию клеток сетчатки, используйте набор для диссоциации нейрональной ткани в соответствии с инструкциями производителя и ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах окрашивающего буфера. Затем перенесите образец в одну лунку 96-луночной U-образной нижней пластины. После центрифугирования переверните планшет, чтобы отбросить надосадочную жидкость и заблокировать рецепторы ФК 25 микролитрами красящего буфера, содержащего антитела CD16, CD32, на лунку в течение пяти минут при комнатной температуре.

Далее пометьте клетки интересующими антителами в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Затем гранулируйте ячейки и после этого промойте 200 микролитрами свежего красящего буфера на лунку. Теперь ресуспендируйте гранулы в 200 микролитрах буфера для окрашивания и красителя для жизнеспособности и перенесите образцы в пробирки с микротитром объемом 1,2 миллилитров.

Затем промыть лунки дополнительными 100 микролитрами красителя для окрашивания и красителя жизнеспособности и объединить промывки с соответствующими образцами для анализа методом проточной цитометрии. Этот метод может быть использован на 10-20-дневных постнатальных или взрослых мышах и может быть адаптирован для проверки влияния соединений и/или генетических манипуляций на микроглиальный фагоцитоз. Например, в этом эксперименте после внутрибрюшинной пробивки с различными дозами ЛПС было определено, что доза ЛПС в 1,42 мг на килограмм индуцирует статистически значимое увеличение процента фагоцитарной микроглии по сравнению с контрольной группой, подвергшейся воздействию.

После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть часов, если она выполнена правильно. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как сортировка клеток с последующей количественной ПЦР или протеомным анализом, чтобы ответить на дальнейшие вопросы о различиях между фагоцитарной и нефагоцитарной микроглией в сетчатке. Разрабатывая эту технику, мы ожидаем, что теперь мы сможем дать возможность ученым, изучающим зрение и нейробиологов, продолжить изучение функции микроглиальных фагоцитов in situ и в физиологически значимом контексте.