Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание
7 января 2019 г.
В этом протоколе мы описываем полный рабочий процесс для быстрой изоляции внеклеточного везикулы от человека цельной крови и характеризация конкретных маркеров путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. Представленные результаты показывают высокий уровень воспроизводимости и может быть скорректирована в supernatants культуры клеток.
Этот метод решает общую проблему в полевых условиях и обеспечивает полный рабочий процесс для быстрой изоляции и характеристики отдельных внеклеточных пузырьков с конкретными маркерами интереса. Анализ слежения за наночастицами является полуавтоматическим методом. Он использует свойства рассеяния света и броуианского движения для анализа распределения размеров внеклеточных пузырьков.
Демонстрацией процедуры будет Вера Шмидт, аспирантка нашей лаборатории. Чтобы изолировать внеклеточные пузырьки, после сбора двух миллилитров образцов всей крови человека в сыворотке,-отделяющих трубки, позволяют образцам свертывать в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем отделить клетки от сыворотки центрифугации. Перенесите один миллилитр сыворотки из каждого образца в отдельные 1,5 миллилитровые реакционные трубки для центрифугации для удаления тромбоцитов и перенесите 100 микролитров плазмы с тромбоцитов в новые 1,5 миллилитровые реакционные трубки.
Далее добавьте 25 микролитров раствора экзосомных осадков в плазму и тщательно вихревые образцы. После 30-минутной инкубации на льду соберите внеклеточные пузырьки путем центрифугации. Гранулы будут отображаться как бежевый или белый цвет.
Аспирировать супернатант и центрифугировать образец снова. Затем удалите все трансы жидкости и повторно помесить гранулы в 100 микролитров PBS. Чтобы испачкать клеточные мембраны пузырьков, добавьте 10 микролитров подвески EV в 50 микролитров свежеприготовленного раствора этанолового красителя PKH67 и тщательно перемешайте.
Через пять минут при комнатной температуре в темноте разбавьте 50 микролитров окрашенной внеклеточной суспензии с 2,5 миллилитров дистиллированной воды в 15-миллилитровой конической трубке с тщательным смешиванием. Чтобы обозначить пузырьки антителами, разбавьте от 10 до 20 микролитров неотренимной внеклеточной суспензии с 50 микролитров дистиллированной воды в 1,5 миллилитровой реакционной трубке с тщательным смешиванием. Добавьте от 2,5 до 5 микролитров антител, представляющих интерес для реакционной трубки, с тщательным смешиванием, для 30-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте.
Затем перенесите 50 микролитров помеченных пузырьков в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую соответствующий экспериментальный объем дистиллированной воды, с тщательным смешиванием, как указано в таблице. Прежде чем анализировать окрашенные или помеченные внеклеточные пузырьки, сначала перемести фильтр флуоресценции в оптический путь микроскопа и камеры, и запустите программу, следуя инструкциям на экране для автоматизированной реализации. Под вкладкой Проверка клеток, выберите правильный номер клетки для измерения флуоресценции и эталонного положения для оптики, чтобы подтвердить, что лазер и микроскоп находятся в общем фокусе.
Используйте шприц, чтобы промыть клеточный канал с 10 миллилитров дистиллированной воды, заботясь о том, что измерительные клетки свободны от пузырьков воздуха и что пузырьки воздуха не вводятся в систему. Далее разбавляют 10 микролитров 200-нанометрового размера флуоресценцией, помеченными полистиролом частицами в 990 микролитров дистиллированной воды, и добавляют 10 микролитров этой частицы суспензии в 15 миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров дистиллированной воды. Затем ввините 2,5 миллилитров раствора первой разбавленной частицы в клеточный канал и нажмите Optimize Focus, чтобы настроить камеру.
Чтобы измерить образец, промыть клеточный канал несколько раз с 10 миллилитров дистиллированной воды и ввести окрашенные внеклеточной подвески пузырьков. Используя эталонную позицию, отрегулируйте соответствующие параметры приобретения под вкладкой Cell Check, как указано в таблице. Чтобы определить оптимальный диапазон чувствительности, нажмите Number of Particles vs.
Чувствительность, для отображения кривой измеренных частиц на экран для различных уровней чувствительности. Для параметра Затвора отрегулируйте период времени, в течение которого камера позволяет свету проходить в течение определенного интервала. Для параметров Postacquisition выберите минимальную яркость 20, минимальный размер 20 нанометров и максимальный размер измерения 500 нанометров.
Обратите внимание на количество обнаруженных частиц в поле зрения дисплея. Бар рассеяния должен быть от зеленого до оранжевого, от 50 до 300 частиц диапазона. Нажмите Проверьте дрейф частиц в нулевом вольте и откройте вкладку Измерения.
Нажмите Run Video Acquisition и установите количество экспериментов до трех-пяти, а задержку времени между экспериментами до нуля минут. Установите количество отдельных субтомных позиций до 11 и количество циклов измерений до 10 в каждом измерительных позициях, в которых должны быть проанализированы частицы. Затем выберите папку, создайте новое имя файла и нажмите Кнопку Хорошо, чтобы начать измерение.
В конце анализа откройте вкладку «Анализ» для проверки результатов. Затем проверьте среднее количество частиц на позицию, общее количество отслеживаемых частиц и концентрацию частиц, ширину распределения частиц, значение среднего и стандартное отклонение. Использование флуоресцентных бусин для регулировки и калибровки измерения дает оптимальную чувствительность настройки 85% Использование этих параметров, камера отображает резкое изображение и повторные измерения демонстрируют низкое стандартное отклонение.
Окрашивание с набором сотового связующих, который включает в себя флуоресцентный клеточный связующий, который включает в себя зеленый флуоресцентный краситель с длинными, алифатными хвостами в липидные области клеточной мембраны, показывает сильную корреляцию между чувствительностью и количеством измеренных частиц. Внеклеточное окрашивание пузырьков антителом к интересному белку указывает на распределение частиц от 220 до 1 145 нанометров, с максимальным максимальным размером 541 нанометров. Никакие внеклеточные пузырьки не обнаруживаются после окрашивания антителами воды, свободной от пузырьков, до чувствительности, близкой к 100%, если измерение начато, когда дрейф превышает 5 микрометров в секунду, отдельные повторения демонстрируют явные отклонения.
Важно отметить, что использование фторсхейна изотиоцианата в качестве фторхрома приводит к неточным и невоспроизводимым измерениям, так как этот фторфор склонен к быстрому фототравмингу. Этот протокол отвечает ведущему спросу многих исследователей в этой области на быструю характеристику одиночных внеклеточных пузырьков с использованием определенных маркеров. Несмотря на то, что за последнее десятилетие методы значительно улучшились, до сих пор нет стандартизированного протокола для анализа отдельных внеклеточных пузырьков.
Независимо от будущего прогресса исследований по внеклеточной биологии пузырьков, этот метод обеспечивает быстрый и надежный протокол для характеристики одиночных внеклеточных пузырьков с использованием конкретных маркеров. Поскольку наши текущие протоколы не предполагают длительного времени обработки или трудоемких шагов, они также подходят для высокой пропускной способности выборки.
Обзор
В данном протоколе описан полный рабочий процесс экспресс-изоляции и характеризации внеклеточных везикул из цельной крови человека. Метод использует анализ трекинга наночастиц на основе флуоресценции для оценки специфических маркеров, демонстрируя высокую воспроизводимость и применимость для супернатантов клеточных культур.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Внеклеточные везикулы
Теоретическая часть
- Внеклеточные везикулы играют ключевую роль в межклеточной коммуникации.
- Изоляция и характеристика этих везикул необходимы для понимания их функций.
- Современным методам может не хватать эффективности и воспроизводимости.
- Данный протокол направлен на решение этих проблем.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод выделения внеклеточных везикул из крови человека.
- Охарактеризовать эти везикулы с использованием методов флуоресценции.
- Углубить понимание биологии внеклеточных везикул.
Используемые методы
- Сбор образцов цельной крови человека.
- Центрифугирование для отделения клеток от сыворотки.
- Использование раствора для осаждения экзосом с целью выделения везикул.
- Флуоресцентное окрашивание и анализ методом отслеживания наночастиц для характеристики.
Основные результаты
- Успешное выделение внеклеточных везикул с образованием видимого осадка.
- Характеристика везикул продемонстрировала диапазон размеров и наличие специфических маркеров.
- Высокая воспроизводимость измерений в нескольких экспериментах.
- Продемонстрированная корреляция между окрашиванием и чувствительностью детектирования частиц.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод анализа внеклеточных везикул.
- Результаты показывают, что этот метод может быть адаптирован для различных типов образцов.
- Данный подход расширяет возможности дальнейших исследований в области биологии внеклеточных везикул.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Быстрая характеристика отдельных внеклеточных везикул (EV) из крови человека на основе флуоресценции устраняет критическое узкое место в рабочих процессах поиска биомаркеров и валидации мишеней. Обеспечивая воспроизводимый, маркер-специфичный анализ EV в клинически значимых жидкостях, данный метод способствует снижению рисков на ранних этапах изучения механизмов и повышает прогностическую достоверность в приложениях жидкой биопсии. Эта возможность улучшает сортировку портфеля проектов, предоставляя количественные стандартизированные данные для принятия решений о продолжении или прекращении (go/no-go) в рамках доклинических программ по исследованию мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выявления специфических поверхностных маркеров (например, CD63, CD9, виментина, LAMP-1) на отдельных внеклеточных везикулах (EV) из сыворотки крови человека.
- Практическая ценность: снижает неопределенность механизмов за счет корреляции флуоресцентного окрашивания с чувствительностью детектирования частиц, что способствует функциональной валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: высокая воспроизводимость между экспериментами, подтвержденная ортогональными методами, такими как вестерн-блоттинг, повышает уверенность при выборе мишеней на ранних этапах.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных, включая концентрацию частиц, распределение по размеру (220–1 145 nm), а также показатели среднего значения и стандартного отклонения для последующего скрининга соединений.
- Масштабируемость: полуавтоматический анализ методом отслеживания наночастиц с оптимизированными параметрами сбора данных (например, чувствительность 85%, минимальная яркость 20 nm) позволяет обеспечить высокую пропускную способность образцов и повторное использование платформы.
- Воспроизводимость: стабильные результаты в нескольких экспериментах и для различных типов образцов (сыворотка, плазма, супернатанты клеточных культур) поддерживают стандартизацию анализа в процессах поиска новых лекарственных средств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Характеристика внеклеточных везикул (EVs) из крови человека обеспечивает релевантную заболеванию систему для перехода от этапа открытия к доклинической валидации.
- Прогресс с учетом рисков: Надежное обнаружение специфических маркеров (например, с помощью окрашивания антителами) позволяет принимать решения на основе биомаркеров в доклинических моделях.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет избежать использования ненадежных флуорофоров (например, FITC), склонных к фотовыгоранию, что обеспечивает целостность данных при изучении механизмов воздействия на мишень.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий: от раннего тестирования гипотез о мишенях через идентификацию ведущих соединений до доклинической валидации, что особенно актуально для программ жидкостной биопсии и разработки биомаркеров.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей за счет возможности профилирования специфических маркеров внеклеточных везикул (EV), выделенных из цельной крови человека.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу количественные данные по характеристикам EV (размер, концентрация, наличие маркеров) для надежной оценки соединений.
- Аналитика: генерирует отслеживаемые измерения частиц, ширину распределения и кривые чувствительности, что позволяет проводить сравнение различных условий и валидацию хитов.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом за счет использования EV человеческого происхождения и клинически значимых маркеров, таких как vimentin и LAMP-1.
- Корпоративное использование: полуавтоматизированный рабочий процесс и адаптивность к плазме, сыворотке и супернатантам клеточных культур позволяют использовать данный метод как масштабируемый и воспроизводимый инструмент для различных исследовательских групп.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в валидации мишени благодаря воспроизводимому анализу отдельных EV с использованием специфических маркеров.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и сокращение времени непосредственной работы за счет полуавтоматического анализа методом отслеживания наночастиц.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях в программах по поиску биомаркеров.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе количественных данных о маркерах EV из образцов человеческой крови.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами флуоресцентного окрашивания, наночастичного трекингового анализа (NTA) и выделения внеклеточных везикул (EV).
- Метод зависит от наличия оборудования, способного осуществлять флуоресцентную детекцию, измерение рассеяния света и автоматизированный захват видео.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов окрашивания (например, PKH67, разведение антител) и параметров захвата (чувствительность, затвор, положения суб-объемов).
- При адаптации метода следует учитывать корректировку концентрации антител (10–20 μL) и времени инкубации (30 min) для различных маркеров в разных модельных системах.
- Практическое ограничение: следует избегать использования изотиоцианата флуоресцеина (FITC) из-за быстрого фотообесцвечивания, которое снижает точность и воспроизводимость измерений.
