Трансфекцию, Селекция, и колонии-сбор человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Тален ориентированные с GFP гена в AAVS1 Safe Harbor

Общая цель данной процедуры заключается в получении изолята AA vs one safe harbor — таргетных индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток или клонов ИПСК, экспрессирующих GFP. Это достигается путем первоначальной эффективной доставки AAVs one talons и донорных плазмид A VS one C-A-G-E-G-F-P в ИПСК методом нуклеофекции. На втором этапе таргетные клетки A a vs one отбирают с помощью пуромицина на фидерных клетках эмбриона мыши.

Затем отдельные клоны, экспрессирующие GFP и таргетированные в локус AAVS1, переносят в 96-луночный планшет, покрытый матригелем. На заключительном этапе клоны AAVS1-GFP-iPSC экспандируют с использованием среды E8 и стандартных методов культивирования iPSC. В итоге для подтверждения равномерной и стабильной экспрессии GFP в таргетированных клонах iPSC человека используют иммунофлуоресцентную микроскопию и проточную цитометрию.

Визуальная демонстрация этого метода крайне важна, так как этапы отбора колоний включают микродиссекцию целевых клонов с использованием специальных инструментов для пикирования колоний под микроскопом, чему трудно научиться в ходе обычного инструктажа. Начните с однократной промывки культур IPSC фосфатно-солевым буфером (PBS). Затем добавьте в каждую лунку один миллилитр реагента для мягкой диссоциации клеток, подогретого до 37 °C, и инкубируйте клетки при 37 °C примерно в течение пяти минут, пока более 50% клеток не отделятся от поверхности культурального сосуда.

Используйте пипетку P 1000 для механического разрушения оставшихся клеточных агрегатов или прикрепившихся клеток. Затем добавьте в каждую лунку по два миллилитра среды E eight и с помощью пипетки на 10 миллилитров дополнительно дезагрегируйте культуры до получения суспензий одиночных клеток. Теперь объедините собранные клетки в конической пробирке объемом 15 миллилитров и центрифугируйте их.

Перевзбейте осадок в минимальном объеме среды E8 для подсчета. После подтверждения жизнеспособности культур методом исключения трипанового синего, а также их достаточной диссоциации, перенесите 3 миллиона клеток в каждую из двух конических пробирок объемом 15 мл. Пока клетки центрифугируются, установите в системе электропорации программу, специфичную для типа клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H9. Затем добавьте 10 мкг только донорной ДНК для гомологичной рекомбинации в один осадок для контрольного образца и 10 мкг плазмиды-донора для гомологичной рекомбинации вместе с 5 мкг каждой плазмиды Talon для экспериментального образца.

Затем добавьте по 100 µL раствора для трансфекции первичных клеток P3 комнатной температуры к каждому из контрольного и экспериментального осадков и ресуспендируйте клетки. Перенесите образцы в отдельные кюветы и проведите электропорацию образцов сразу после трансфекции. Добавьте по 500 µL среды E8 комнатной температуры в каждую кювету, после чего перенесите трансфецированные образцы iPSC покапельно в отдельные 10-сантиметровые чашки, содержащие эмбриональные фибробласты мыши DR4. Перед отбором колоний нанесите в каждую лунку 96-луночного планшета по 50 µL раствора матрикса базовой мембраны, затем храните планшет в течение ночи при 4 °C.

Когда планшет достигнет комнатной температуры, аспирируйте излишки раствора и внесите в каждую лунку 100 µL среды E eight, дополненной 10 µM Y 2 7 6 3 2. Затем поместите инвертированный микроскоп в шкаф биологической безопасности и стерилизуйте его легким распылением 70% ethanol. После этого подвергните стеклянную пастурелла-пипетку воздействию пламени горелки Бунзена, чтобы создать инструмент для переноса колоний с крошечным крючком на кончике, предварительно стерилизовав его 70% ethanol.

Поместите крючок в вытяжной шкаф для просушки, затем установите культуру IPSE на предметный столик микроскопа для отбора клонов. Найдите подходящую колонию при малом увеличении и с помощью инструмента для отбора колоний обведите и разделите ее на четверти. Затем аккуратно соскребите четверть колонии с сосуда для культивирования и, используя дозатор P 200, установленный примерно на 30 µL, соберите свободно плавающие IPC, высаживая клетки непосредственно на матрикс базальной мембраны.

После сбора IPC должны прикрепиться в течение двух-четырех часов после посева. Наконец, инкубируйте отобранные колонии в течение ночи при 37 °C и обновите среду для клеток, добавив полную среду E eight на следующее утро. Важно трансфецировать только высококачественные iPSC на протяжении всего эксперимента.

Культуры иПСК должны содержать преимущественно отдельные колонии с морфологией, напоминающей «булыжную мостовую», как у клеток, представленных здесь, а доля дифференцированных клеток не должна превышать 10% культуры. Возможность трансфекции иПСК может быть оценена и оптимизирована с использованием малого вектора PAX GFP, поскольку трансфекция PAX GFP обычно демонстрирует максимально достижимую эффективность благодаря малому размеру вектора. Транзиентная экспрессия A VS one C-A-G-E-G-F-P в трансфицированных иПСК достигает пика через 48–72 часа после трансфекции, что может быть подтверждено методом проточной цитометрии на небольшой части трансфицированных клеток. Эффективность трансфекции может существенно варьироваться.

Даже в экспериментах с A GFP положительная фракция составляет всего 10%. Отдельные клоны с однородной фруоресценцией должны достичь достаточного размера для отбора колоний после селекции чистым мицином. Кроме того, после переноса в 96-луночный формат экспандированные целевые клоны iPSC должны демонстрировать стабильную и однородную экспрессию GFP. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как эффективно трансфицировать iPSC методом нуклеофекции и как изолировать AV one safe harbor.

Выбор целевых клонов IPSE с помощью инструментов для пикирования колоний.