Выбор и изоляция Колонии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из взрослых Перепрограммированный Фибробласты

В данной видеостатье показано перепрограммирование взрослых фибробластов человека для получения плюрипотентных стволовых клеток с использованием ретровирусных векторов. Сначала фибробласты человека трансдуцируют ретровирусными векторами, кодирующими факторы транскрипции T three four, SOX two, KLF four и cmic.

Инфицированные фибробласты культивируют на фидерных клетках эмбриона мыши в течение от 14 до 28 дней. Полученные культуры окрашивают антителами к TRA 180 1 для идентификации колоний репрограммированных клеток. Положительные колонии затем переносят на планшеты, содержащие MEF, для экспансии.

Иммуноцитохимическое окрашивание подтверждает экспрессию маркеров плюрипотентности и создание линий плюрипотентных стволовых клеток. Затем следует провести дополнительные исследования для более детальной характеристики этих линий. Как правило, специалисты, только начинающие работу с перепрограммированием соматических клеток и культурами индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, сталкиваются с определенными трудностями, так как правильно идентифицировать колонии ИПСК довольно сложно.

Процедуру продемонстрирует доктор Сула Поллак, постдок из моей лаборатории. Начните процедуру с посева клеток Phoenix AM FO с плотностью примерно 7–8 миллионов клеток на одну 10-сантиметровую чашку в 10 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы; поместите чашки в инкубатор и культивируйте в течение ночи. На следующий день подготовьте смеси для трансфекции, состоящие из 12 мкг вектора, кодирующего либо T34SOX, 2klf, 4cmic или ген GFP, и 35 мкл FuGENE 6, при общем объеме 500 мкл безсывороточного DMEM с высоким содержанием глюкозы и L-глутамином.

Инкубируйте смеси в течение 20 минут. Затем для трансфекции клеток phoenix осторожно внесите комплексы ДНК пипеткой в планшеты с клетками phoenix, конфлюэнтность которых должна составлять 70–80%. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение шести-восьми часов.

Оспиригуйте среду и замените ее восемью миллилитрами DMEM с высоким содержанием глюкозы и антибиотиками. Затем верните планшеты в инкубатор на 12 часов после инкубации. С помощью пипетки аспирируйте и соберите среду, содержащую вирус.

Затем замените среду и повторяйте этот процесс каждые 12 часов, пока среда не будет собрана четыре раза. Храните среду при температуре 4 °C. После сбора всей среды объедините все порции, затем профильтруйте её через трубчатый фильтр с размером пор 0,45 µm в коническую пробирку объемом 50 mL для удаления отделившихся клеток и клеточного дебриса.

Отфильтрованная среда, содержащая вирусные частицы, может храниться в холодильнике в течение двух недель без потери инфекционной активности. Замораживание не рекомендуется. За день до процедуры трансдукции разморозьте замороженный сток взрослых фибробластов человека и высейте 1 × 10⁵ клеток в каждую лунку шестилуночных планшетов, покрытых желатином.

На следующий день в конической пробирке объемом 50 мл смешайте по 3,5 мл T four SOX two, klf four и вирусной среды cmic, и добавьте poly brain до конечной концентрации 6 мкг/л в качестве контроля. Приготовьте 1 мл вирусной среды GFP, 3 мл культуральной среды и poly brain в конечной концентрации 6 мкг/мл. Аспирируйте среду из планшета с человеческими фибробластами.

Затем добавьте четыре миллилитра смешанной вирусной среды или контрольной среды и центрифугируйте планшеты при 1600 G в течение одного часа при 20 °C. После центрифугирования инкубируйте планшеты примерно 12 часов. Затем замените вирусную среду средой для культивирования фибробластов и инкубируйте еще 12 часов.

Повторите этот процесс, от инфицирования до культивирования в среде для фибробластов, еще дважды после последнего инфицирования. Культивируйте фибробласты в DMEM в течение 48 часов. Затем проверьте эффективность инфицирования параллельных трансдукций с использованием ретровирусной среды с GFP.

Далее следует начать перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентные. Инфицированные фибробласты культивируют в среде для эмбриональных стволовых клеток человека или среде HES; высевают эмбриональные фибробласты мыши или MEF с плотностью примерно 2 × 10⁵ клеток на лунку в шестилуночный планшет, обработанный желатином, в среде для роста фибробластов на следующий день.

Разделите инфицированные фибробласты человека с помощью 0,05% трипсина-ЭДТА и посейте их с плотностью примерно 1,2 × 10⁴ на лунку в среде для роста фибробластов. На следующий день замените среду на среду HES, содержащую 0,5 мМ бутирата натрия, для первых семи дней репрограммирования.

Ежедневно заменяйте среду. Замените среду на среду HES без бутирата натрия и продолжайте репрограммирование в течение дополнительных 7–21 дней. Производите замену среды ежедневно.

Проверьте трансдуцированные клетки на наличие морфологических изменений. Колонии клеток начнут появляться примерно через 10 дней после переноса трансдуцированных фибробластов на фидерные клетки. Колонии, содержащие репрограммированные клетки, теперь называют индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека или человеческими IPS-клетками.

Колонии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека будут готовы к изоляции через 14–28 дней после высева на фидерные клетки ЭМФ. На этом этапе колонии ИПСК человека можно перенести либо на планшеты с ЭМФ, либо на планшеты, покрытые матригелем. Перенос на планшеты с ЭМФ демонстрируется за день до сбора колоний ИПСК человека. Подготовьте 24-луночные планшеты с гамма-облученными фидерными клетками ЭМФ в среде для роста фибробластов.

В день сбора колоний индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека инкубируйте их при 37 °C в атмосфере с 5% CO2. Аспирируйте среду для роста фибробластов из ME Fs и промойте их PBS для удаления остатков FBS. Затем добавьте в каждую лунку 0,5 мл среды для эмбриональных стволовых клеток человека (HES-среды), содержащей 10 µM ингибитора ROCK Y 2 7 6 3 2; после этого, используя микроскоп, установленный в ламинарном шкафу, проверьте планшеты для репрограммирования на предмет формирования колоний ИПСК человека.

При необходимости удалите фибробласты, окружающие колонии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPS) человека, с помощью иглы 21G. Промойте планшеты PBS и добавьте свежую среду HES, содержащую специфические антитела к антигену TRA 180 1 для окрашивания живых клеток. Поместите клетки обратно в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.

Через 30 минут замените среду на свежую среду HES с добавлением 10 µM ингибитора ROCK. Затем осмотрите колонии под флуоресцентным микроскопом. Пометьте от 1 до 81 колонии, положительной по TRA.

С помощью объективного маркера и иглы 21-го калибра разрежьте колонии положительных по TRA 180 1 индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека на несколько маленьких фрагментов. Затем с помощью автоматического дозатора перенесите фрагменты колоний ИПСК человека в отдельные лунки 24-луночного планшета с фибробластами эмбрионов мыши (ME Fs). Избегайте переноса клеток, не являющихся ИПСК.

Поместите планшеты в инкубатор и оставьте колонии человеческих иПСК для прикрепления на 24–36 часов, ежедневно меняя среду. Колонии человеческих иПСК с правильной морфологией, напоминающей эмбриональные стволовые клетки (HE), станут видны через 48 часов после первоначального переноса в 24-луночный планшет. Выполняйте ручной пассаж колоний человеческих иПСК каждые шесть–восемь дней, разделяя их с помощью иглы 21G. После клонального расширения переносите растущие культуры в 12-луночный, а затем в 6-луночный планшет.

После создания линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека с помощью иммунохимического анализа оценивают экспрессию маркеров плюрипотентности TRA-1-60, SSEA-4, T, 3, 4, SOX2 и nanog. Подробная характеристика может включать анализ дифференцировки in vitro и in vivo, кариотипический анализ, анализ сайленсинга трансгена, исследования метилирования и экспрессии генов.

Эффективная трансдукция с использованием среды, содержащей ретровирус, имеет решающее значение для успешного репрограммирования с целью определения эффективности вирусной трансдукции. Фибробласты взрослых людей, полученные от пациента с атаксией Фридрейха, были визуализированы после двух последовательных заражений ретровирусной средой с GFP; при заражении фибробластов путем простой инкубации с вирусной средой трансдуцировалось менее 20% клеток. Однако при незамедлительном добавлении ретровирусных сред с GFP эффективность трансдукции резко возросла.

Здесь более 80% клеток подверглись трансдукции для проведения первичной характеристики изолированных колоний индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток человека. Экспрессия маркеров плюрипотентности, характерных для эмбриональных стволовых (ЭС) клеток человека, была оценена методом иммунохимического анализа, как показано здесь. Изолированные колонии ИПС-клеток человека оказались положительными по маркерам плюрипотентности.

T three four, SOX two, nano SSEA four и TRA one 60 DNA. Ко-окрашивание с DPI, показанное на верхних панелях, обнаруживается как в колониях человеческих ИПС-клеток, так и в фидерных клетках. Эти результаты демонстрируют, что человеческие ИПС-клетки, полученные с помощью данного протокола репрограммирования, экспрессируют соответствующие маркеры плюрипотентности, характерные для недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как успешно перепрограммировать фибробласты человека в плюрипотентные стволовые клетки с помощью ретровирусной трансдукции, выявлять правильные колонии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и проводить их первичную характеристику.