Отслеживание наркотиков изменений, вызванных в рецептора после интернализации торговле от анализа Colocalizational

Общей целью данного эксперимента является количественная оценка пространственной колокализации пар мишеней, в данном случае изучение наркоиндуцированного трафика рецепторов. Это достигается путем обработки живых культивируемых клеток препаратом, индуцирующим измененный транспорт рецепторов. В качестве второго шага двойное иммуномаркирование рецепторов-мишеней и внутриклеточных компартментов позволяет осуществить пространственную локализацию пар-мишеней с помощью многоканальной конфокальной микроскопии.

Количественный анализ колокализации используется для измерения тенденции рецепторов-мишеней и компартментов обнаруживаться в одном и том же месте. Результаты показывают изменения в трафике рецепторов после медикаментозного лечения, основанные на колокализации рецепторов и внутриклеточных компартментах транспорта. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как колокация наложения, заключается в том, что он обеспечивает количественные меры колокализации, которые затем позволяют проводить гораздо более эффективные анализы и сложные экспериментальные планы.

Хотя этот метод может дать представление о транспортировке рецепторов, он также может быть применен к изменениям в пространственной колокализации практически любых двух белков в культивируемых клетках. Чтобы начать эту процедуру, удалите исходную питательную среду и замените ее средой, содержащей интересующий препарат в выбранной концентрации. Далее инкубируйте клетки в исходных условиях роста в течение выбранной продолжительности лечения.

После инкубации аккуратно промойте клетки одним миллилитром промывочного буфера каждый раз в течение трех раз. Зафиксируйте клетки 300 микролитрами 4%-ного параформальдегида в 0,1 моляре PBS на 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем снова промойте ячейки одним миллилитром промывочного буфера каждый раз по три раза.

Впоследствии инкубируйте клетки в 300 микролитрах блокирующего буфера в течение двух часов при комнатной температуре. После этого инкубируют клетки с первичным антителом в 300 микролитрах разбавителя антител в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия. Затем аккуратно промойте ячейки одним миллилитром промывочного буфера каждый раз в течение трех раз.

Затем инкубируйте клетки с вторичным антителом, конъюгированным с фтором в 300 микролитрах разбавителя антител в течение одного часа комнатной температуры, и защитите клетки от света. Через час аккуратно промойте клетки одним миллилитром промывочного буфера каждый раз по три раза. Чтобы снять крышку с 24-луночной пластины, удерживайте пластину под углом 45 градусов.

Поместите кончик пары тонких щипцов на верхний край защитного листка, где он соприкасается с дном колодца. Затем осторожно откиньте крышку в буфере для мытья в сторону от дна колодца. Защитное стекло будет упираться в стенку колодца, где его можно будет легко снять с помощью щипцов.

Затем установите защитные стекла ячейками вниз на предметные стекла микроскопа с защитой от выцветания с помощью объектива с 100-кратным увеличением. Во-первых, найдите репрезентативную клетку для визуализации с помощью эпифлуоресценции. Затем настройте параметры захвата изображений Записывайте восьмибитные несжатые изображения в формате tiff для каждого помеченного канала, чтобы последовательно отображать каждый канал и усреднять от четырех до шести сканирований для окончательного изображения.

Затем переключитесь на конфокальную траекторию визуализации и сфокусируйтесь на плоскости Z через центр клетки. Оптимизируйте мощность точечного лазера, напряжение и смещение фотоумножителя для каждого канала. Запишите эти настройки и используйте те же настройки для отображения всех ячеек, помеченных для любой заданной целевой пары.

В этом же разделе Replicate следующие клетки-локаторы будут визуализированы с объективом с большим увеличением. Используя эпифлуоресценцию, переключитесь на конфокальную траекторию визуализации и сфокусируйтесь на плоскости Z через центр клетки, если таковая имеется. Используйте программную функцию масштабирования обрезки, чтобы ограничить область сканирования интересующей ячейкой. Впоследствии.

Захватите изображения для каждого помеченного канала с использованием ранее установленных параметров и повторите процедуры для получения изображения 15 или более ячеек на условие для каждой репликации. Для обеспечения достаточного количества образцов. В этой процедуре откройте пару изображений ячейки на изображении J.Используйте команду слияния цветов изображения для создания изображения RGB.

Затем обведите вокруг себя интересующую клетку. Используйте плагин image j для колокализации SC для количественной оценки колокализации целей в выбранной ячейке. Запишите требуемую меру колокализации и повторите процедуру для каждой ячейки изображения.

Затем вычислите среднее значение записанных значений колокализации общих условий управления для каждой репликации каждого условия маркировки. Умножьте среднее значение на минус один, чтобы получить смещение для каждой репликации в каждом условии маркировки. Затем добавьте смещение для каждой репликации в каждом условии маркировки к каждому значению колокализации в этой реплике.

Это позволит нормализовать данные таким образом, что средняя мера колокализации для общего контрольного условия равна нулю при каждой репликации каждого условия маркировки. После этого все данные со всех реплик каждого условия маркировки позволят проанализировать изменения в колокализации между репликами. Здесь показаны первичные культуры сенсорных нейронов ганглиев дорсальных корешков, которые подвергались длительному и острому медикаментозному лечению. Затем клетки были иммунопомечены дельта-опиоидными рецепторами и маркером рециркуляционных эндосом с четкими первичными вторичными парами антител и визуализированы с помощью двухканальной последовательной конфокальной микроскопии.

В дополнение к последующей количественной колокализации и анализу, эти репрезентативные изображения были обработаны для создания карт колокализации в ложных цветах, показанных здесь. Средние баллы колокализации дельта-опиоидных рецепторов и маркеров ранних эндосом, рециркуляции эндосом и колокализации рецепторов лизосом с каждым компартментом сравниваются между группами, получающими различные острые лекарственные препараты, и наблюдаются лекарственно-индуцированные изменения в транспортировке рецепторов. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о приобретении высококачественных последовательных микрофотографий, чтобы обеспечить достоверный количественный анализ.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить количественный анализ колокализации.