Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов ( Microcystis палочки), Используя проточной цитометрии
29 января 2016 г.
Микробные популяции содержат значительное гетерогенность клеток, которые могут диктовать общее поведение. Анализ молекулярной зонд через проточной цитометрии можно определить физиологические состояния клеток, однако его применение зависит от вида. Это исследование обеспечивает протокол точно определить сотовый смертности в популяции цианобактерии, не преуменьшая или записи ложные положительные результаты.
Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как создать протокол, который может эффективно анализировать физиологическое состояние цианобактерий с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о клеточной физиологии микробных сообществ. Основное преимущество этой процедуры заключается в том, что оптимизированный протокол флуоресцентного зонда может различать физиологические состояния цианобактерий на уровне отдельных клеток в режиме реального времени.
Демонстрировать эту процедуру будет Дэвид Хартнелл, аспирант, работающий в лаборатории цитометрии в Борнмутском университете. Перед началом эксперимента поместите пустую гемолизную трубку на зонд для инъекции образца. Нажмите «Очистить».
А затем провести обратную промывку, чтобы начать процесс очистки проточной цитометрии. В конце обратной промывки загрузите новую гемолизную трубку, содержащую два миллилитра ультрачистой отфильтрованной воды, в зонд для впрыска образца или SIP и установите ограничение по времени от 10 до 15 минут, а скорость жидкости — быструю. Затем выберите новую ячейку данных и установите соответствующие пороги флуоресценции и рассеяния света для уменьшения фонового шума.
Затем нажмите «Выполнить». Если общее количество событий в секунду не меньше рекомендованного производителем, запустите два миллилитра обеззараживающего раствора в течение двух минут на быстром. И повторите шаги обратной промывки и промывки сверхчистой водой.
Для приготовления первичной монокультуры M.aeruginosa в автоклаве 98 миллилитров ультрачистой фильтрованной воды, смешанной с двумя миллилитрами водорослевой среды, в стакане объемом 250 миллилитров в течение 20 минут при температуре 120 градусов Цельсия. Когда культура находится в высоком устойчивом состоянии плотности, дезагрегируйте два миллилитра клеток с помощью вортекса. А затем перенести клетки под зонд для введения образца.
Подтвердите равномерное распределение клеток с помощью световой микроскопии. Затем выберите график гистограммы в программном обеспечении проточного цитометра, чтобы записать данные прямого рассеяния света. И нажмите кнопку Log, чтобы просмотреть данные в масштабе журнала по оси X.
В отдельном выходе установите еще одну гистограмму логарифмической оси, чтобы записать естественную флуоресценцию клеток M.aeruginosa. Далее выберите источник света, способный возбуждать фикоцианин, и детектор, способный фильтровать излучения от образующейся флуоресценции. Для записи в самом высоком разрешении выберите настройки, наиболее близкие к размеру ядра целевого организма.
И установите относительно медленный расход. Перед получением данных установите пороговое значение для подавления любых сигналов рассеяния света и флуоресценции, вызванных электронным фоновым шумом или мусором образца клетки. Затем выберите новую ячейку данных.
Создайте график плотности с параметрами прямого и бокового рассеяния в логарифмической шкале и нажмите кнопку «Выполнить». Теперь примените прямое рассеяние света и естественный флуоресцентный затвор к данным прямого параллельного рассеяния, чтобы исключить любые сигналы рассеяния низкого уровня и включить только более высокие сигналы фикоцианина относительной флуоресценции. Затем собирайте события до тех пор, пока выборка не будет завершена, и используйте данные для определения начального количества ячеек.
Чтобы оптимизировать поглощение молекулярных зондовых клеток, подвергните половину предварительно подготовленной монокультуры воздействию соответствующих условий для создания мертвого контроля. Проверьте изменения в микроокружении образца, чтобы подтвердить гибель культуры. А затем разукрупните образование колоний, как только что продемонстрировано.
Затем выберите 488-нанометровый лазер вместе с детектором, который может регистрировать флуоресценцию от зеленого и оранжевого зондов нуклеиновых кислот. И 640-нанометровый лазер для регистрации сигналов фикоцианина через соответствующие детекторы. В новом техническом описании настройте график плотности с параметрами прямого и бокового рассеяния.
Затем создайте одну гистограмму с использованием соответствующего канала оптического детектора молекулярного зонда. Одна гистограмма для обнаружения выбросов фикоцианина и одна гистограмма для событий прямого рассеяния, все в логарифмической шкале. Проведите отбор проб цианобактерий с использованием различных концентраций и времени инкубации.
Создайте вентиль в гистограмме прямого рассеяния, чтобы включить в нее события только с размером клетки целевого организма. И прикладываем его к соответствующему каналу флуоресцентного зонда. Затем в канале флуоресцентного зонда создайте еще один включающий программный вентиль против самого высокого пика на гистограмме.
И впоследствии забивать соответствующую положительную флуоресценцию зонда на график плотности. Сравните количество сигналов флуоресценции с числом мертвых контрольных клеток, где наибольший процент поглощения клеточного нуклеинового зонда не вызывает неспецифического окрашивания. Для проверки перекрытия флуоресцентной интерференции при собственном или неспецифическом окрашивании клеток выберите 50 процентов живых и 50 процентов мертвых данных смешанных культур.
И снимите люминесцентные затворы. Примените вентиля, чтобы включить в гистограмму фикоцианинового канала только гистограмму прямого рассеяния для размера клеток целевого организма. Закрытие верхних и самых низких пиков фикоцианина и маркировка их как живые и мертвые, соответственно.
Затем отдельно прикладывают затворы к живому и мертвому сигналам фикоцианина. И записать обе средние длины волн. Чтобы определить чувствительность протокола, соотнесите средние длины волн положительного флуоресценции мертвого молекулярного зонда и собственный неспецифический живой сигнал.
Наконец, выберите оптимизированный протокол, в котором было окрашено наибольшее количество мертвых клеток без возникновения неспецифического окрашивания. На этих графиках показаны репрезентативные выходы прямого и бокового рассеяния света для размера клеток и внутренней сложности культуры партии M.aeruginosa в экспоненциальной фазе. Стробирование может быть выполнено путем уточнения данных между определенными точками прямого рассеяния света.
Фикоцианин производит сильный сигнал при опросе красным источником света, который может быть использован для дальнейшего контроля за популяциями, представляющими интерес. От прямого рассеяния света и флуоресцентных сигналов данные могут быть затем стробированы от исходного выходного сигнала до конкретных данных на образце M.aeruginosa для окончательного подсчета клеток. Когда живые элементы с более высокой пигментацией и мертвые элементы с более низкой пигментацией смешиваются, становится очевидным уменьшение сдвига в автофлуоресценции.
В мембранных клетках зонды нуклеиновых кислот производят дополнительный сигнал, который можно наблюдать с помощью проточной цитометрии и в дальнейшем подтверждать с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Флуоресцентная дискриминация между живыми и мертвыми клетками увеличивается со временем между 0,05 и 0,5 микромолярными концентрациями, но уменьшается между 1 и 100 микромолярными концентрациями для обоих зондов. Действительно, оптимальная концентрация для зонда зеленых нуклеиновых кислот составляет 0,5 микромоляра с временем инкубации 30 минут.
Для зонда оранжевых нуклеиновых кислот оптимальная концентрация составляет один микромоляр для 10-минутной инкубации. После освоения для каждого молекулярного зонда оптимизация может быть завершена за день, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о хранении зондов в стабильной среде, при соответствующей температуре, pH и освещенности.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области микробиологии к изучению гетерогенности сообществ в фитопланктоне. Посмотрев видео, вы теперь должны хорошо понимать, как разработать оптимальный протокол оценки клеточной физиологии с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Не забывайте, что работа с молекулярными зондами и токсичными организмами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующего P.P.E. и полное понимание материалов COSHH.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол анализа физиологических состояний цианобактерий с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Метод направлен на точное определение смертности клеток в микробных популяциях, что позволяет решить проблему гетерогенности клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Проточная цитометрия
Теоретические сведения
- Микробные популяции демонстрируют значительную гетерогенность клеток.
- Проточная цитометрия позволяет оценивать физиологическое состояние, но результаты варьируют в зависимости от вида.
- Точное измерение гибели клеток имеет решающее значение для понимания микробных сообществ.
- Оптимизированные флуоресцентные зонды позволяют улучшить анализ на уровне отдельных клеток.
Цель исследования
- Разработка надежного протокола для оценки физиологии цианобактерий.
- Повышение точности определения смертности клеток.
- Облегчение анализа физиологических состояний цианобактерий в режиме реального времени.
Используемые методы
- Проточная цитометрия для анализа клеток.
- Молекулярные зонды для дифференциации физиологических состояний.
- Оптимизация протокола для получения точных результатов.
- Демонстрация аспирантом в лаборатории цитометрии.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет эффективно дифференцировать физиологические состояния цианобактерий.
- Было достигнуто точное определение гибели клеток.
- Анализ в режиме реального времени позволил получить представление о поведении микроорганизмов.
- Результаты способствуют пониманию особенностей популяций цианобактерий.
Выводы
- Разработанный протокол расширяет возможности анализа физиологии цианобактерий.
- Он устраняет прежние ограничения при измерении смертности клеток.
- Данный метод может быть применен в различных микробиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точная оценка жизнеспособности клеток в микробных системах способствует валидации мишеней на ранних этапах, обеспечивая надежный фенотипический скрининг и снижение механистических рисков. Проточная цитометрия с оптимизированными молекулярными зондами предоставляет количественные данные с разрешением на уровне отдельных клеток, что повышает прогностическую достоверность при поиске перспективных соединений-лидеров. Данный подход позволяет решить проблему гетерогенности в биологических исследованиях, облегчая принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки и снижая биологические риски на поздних стадиях создания противомикробных или противоинфекционных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных клеток в микробных популяциях.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством оценки целостности мембран с использованием зондов SYTOX Green и SYTOX Orange.
- Прогностическая ценность: оптимизированные концентрации зондов (0.5 µM зеленого, 1.0 µM оранжевого) минимизируют количество ложноотрицательных результатов и неспецифического окрашивания, повышая надежность анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых показателей флуоресценции для высокопроизводительного скрининга соединений при поиске антимикробных средств.
- Количественный выход: позволяет точно измерять поглощение зонда как зависимую переменную для моделирования зависимости «доза-эффект».
- Масштабируемость: оптимизация протокола на Microcystis aeruginosa создает переносимую основу для других цианобактериальных или микробных систем.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: Обеспечивает доклиническое моделирование антимикробной эффективности путем количественного определения вызванной соединением смертности целевых патогенов.
- Трансляционная преемственность: Связывает скрининг жизнеспособности на этапе поиска с доклинической валидацией с помощью согласованных конечных точек на основе проточной цитометрии.
- Прогресс с учетом рисков: Снижает механистическую неопределенность при оптимизации ведущих соединений, предоставляя физиологические данные на уровне отдельных клеток в режиме реального времени.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя данные о механизмах действия, которые позволяют принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении соединений.
- Открывающая биология: Облегчает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем сопоставления воздействия соединений с изменениями жизнеспособности клеток.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет оптимизации параметров инкубации и концентрации зондов.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения флуоресценции для статистического сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Способствует согласованию биомаркеров путем связы за показателей целостности мембран с механизмом действия соединений.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу цитометрии, применимую для различных микробных мишеней в рамках антиинфекционных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения количества ложноположительных показателей жизнеспособности путем оптимизации зондов.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию в различных лабораториях благодаря определению концентраций зондов и времени инкубации.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах отсеивать соединения, не обладающие мишень-специфической активностью.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков путем дифференциации соединений с истинным антимикробным действием от артефактов анализа.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с проточной цитометрией и компенсацией флуоресценции для многопараметрического детектирования.
- Зависит от наличия доступа к проточным цитометрам, совместимым с лазером 488 нм, и имеющим соответствующие каналы детектирования для красителей SYTOX.
- Необходима стандартизация протоколов между исследовательскими группами для обеспечения единообразия при работе с зондами, их хранении и применении.
- Потребуется адаптация метода при его переносе на модели грамположительных или грамотрицательных бактерий.
- Включает такие практические ограничения, как токсичность зондов и необходимость соблюдения мер биологической безопасности при работе с токсичными организмами, такими как Microcystis aeruginosa.
