Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living
2 апреля 2016 г.
Визуализация динамического поведения органелл и других субклеточных структур in vivo может пролить свет на их функцию в физиологических и патологических условиях. В данной работе мы представляем методы генетической маркировки двух органелл, центросом и митохондрий, а также визуализации их динамики в живых эмбрионах рыбок данио-рерио с помощью широкоугольной и конфокальной микроскопии.
Общая цель данного метода визуализации заключается в изучении субклеточных органелл позвоночного животного in vivo. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии нейронов, такие как динамика митохондрий или центросом в условиях in vivo. Главным преимуществом данной методики является то, что весь эксперимент может быть проведен на неповрежденном организме позвоночного без необходимости хирургического вмешательства.
Данный метод позволяет получить представление не только о субклеточной динамике в физиологических условиях, но и может быть применен при изучении патологических моделей, таких как болезнь Альцгеймера. После получения эмбрионов с транзиентной экспрессией путем микроинъекций или получения эмбрионов от стабильных трансгенных линий согласно текстовому протоколу, в конце первого дня проведите отбор, чтобы удалить погибшие или неоплодотворенные икринки. С помощью пластической переносящей пипетки перенесите жизнеспособные эмбрионы в раствор Данио, содержащий 1x PTU для предотвращения образования пигмента, и поддерживайте эмбрионы в растворе Данио с 1x PTU до проведения анализа экспрессии трансгена.
В день проведения эксперимента по визуализации используйте флуоресцентный стереомикроскоп для скрининга анестезированных эмбрионов на экспрессию трансгена. Затем перенесите отобранных эмбрионов в отдельную чашку Петри с буфером Данио, содержащим 1x PTU и 1x трикаин. После того как эмбрионы будут анестезированы, осторожно перенесите несколько из них с помощью пипетки в низкоплавкий агароз, содержащий 1x PTU и 1x трикаин, стараясь переносить как можно меньше жидкости, чтобы избежать разбавления агарозы.
Перенесите эмбрионы с небольшим количеством агарозы в чашку Петри с стеклянным дном. Затем, действуя достаточно быстро, с помощью пинцета расположите эмбрионы в нужном положении в зависимости от структуры, которую необходимо визуализировать. Эмбрионы должны быть ориентированы правильно; например, плотно на боку для визуализации сетчатки или нейрона Рохона-Бирда.
Точная ориентация обеспечит наилучшее качество изображения и оптимизирует скорость сбора данных. После того как агароза затвердеет (минимум 15 минут), добавьте буфер Danieau с 1x PTU и 1x трикаином, чтобы покрыть эмбрионы. Для проведения широкопольной микроскопии, после уравновешивания чашки с закрепленными рыбами в термостате при 28.5 °C на предметном столике широкопольного микроскопа и выбора интересующей области, откройте программное обеспечение микроскопа.
В разделе «Освещение» (Illumination) выберите «Настройки конфигурации» (Configuration settings), чтобы определить подходящие наборы фильтров для интересующей длины волны. В разделе «Настройки камеры» (Camera settings) введите время экспозиции, необходимое для получения качественного изображения. Затем выберите иммерсионный объектив с длинным рабочим расстоянием для погружения в воду с увеличением от 40x до 100x, имеющий наибольшую числовую апертуру и ахроматическую коррекцию.
Нажмите на Live, чтобы выбрать поле зрения. В случае R-B нейрона выберите для визуализации транспорт митохондрий в области ствола аксона, исходящего из тела клетки, или в периферическом дереве. Затем в меню ImageJ нажмите кнопку прямоугольного выделения и определите область интереса (ROI).
Затем нажмите на ROI в окне micromanager. После выбора ROI для визуализации нажмите Stop and Save, чтобы записать морфологию нейронов в канале YFP. Для визуализации митохондриального транспорта нажмите на Multi-D Acquisition.
Затем в окне Multi-dimensional Acquisition выберите количество временных точек и интервал между ними. В этом же окне перейдите в раздел Channels, чтобы добавить и задать длину волны для визуализации и время экспозиции. Нажмите Save images, чтобы файлы автоматически сохранялись в папку, указанную в пути к каталогу.
Теперь нажмите кнопку Acquire в верхнем правом углу, чтобы начать таймлапс-визуализацию. Для конфокальной микроскопии, после помещения закрепленных эмбрионов в термокамеру при температуре 28.5 °C на предметном столике конфокального микроскопа, откройте программное обеспечение микроскопа и нажмите Trans Lamp или Epi Lamp. Затем, глядя в окуляры микроскопа, используйте проходящий или флуоресцентный свет соответственно, чтобы определить область интереса.
В окне настроек сбора данных (Acquisition) убедитесь, что объектив, выбранный для визуализации, совпадает с объективом, указанным в выпадающем меню доступных объективов. Затем в окне управления сбором изображений (Image Acquisition Control) нажмите кнопку списка красителей и выберите соответствующие флуорофоры. В качестве альтернативы можно нажать кнопку «Световой путь и красители» (Light Path and Dyes) для ручной настройки параметров.
В окне параметров сбора данных (Acquisition Setting) отрегулируйте коэффициент увеличения и соотношение сторон сканируемого изображения, чтобы получить размер пикселя, необходимый для наилучшего разрешения визуализируемых структур. Установите размер пикселя примерно в два раза меньше теоретического разрешения объектива, следуя тем самым критериям выборки Найквиста. Чтобы определить размер пикселя полученного изображения, в окне управления сбором изображений (Image Acquisition Control) нажмите кнопку I.
Затем установите максимально возможную скорость сканирования. После этого в окне управления сбором изображений (Image Acquisition Control) выберите усреднение линий по методу Калмана (Kalman line averaging) и установите коэффициент два или три для снижения уровня шума. Чтобы выбрать режим последовательного сканирования для визуализации флуорофоров с перекрывающимися спектрами, нажмите Sequential и Line.
Затем отрегулируйте выходную мощность соответствующих линий лазера. Чтобы непрерывно сканировать выбранную область, настраивая параметры детектора для каждого канала, нажмите XY Repeat, Focus x2 или Focus x4. После этого настройте HV, Gain и Offset для каждого канала, чтобы получить изображения с максимально широким динамическим диапазоном градаций серого.
Теперь нажмите Control + H, чтобы визуализировать полученные изображения с помощью таблицы поиска (lookup table), которая помечает недонасыщенные пиксели синим цветом, а перенасыщенные — красным; обоих вариантов следует избегать. Повторно оцените выходную мощность соответствующих линий лазера и настройки детектора. Чтобы определить верхнюю и нижнюю границы объема для визуализации, в окне Acquisition Setting нажмите кнопку End Set на верхней границе, затем сфокусируйтесь на нижней границе и нажмите Start Set.
Чтобы проверить разрешение объектива по оси Z, в окне Image Acquisition Control нажмите на символ I. Затем выберите размер шага, равный половине Z-разрешения для данного объектива. В под-окне TimeScan введите частоту получения Z-стеков и количество циклов получения изображений, чтобы настроить временную серию, соответствующую динамике исследуемой субклеточной структуры.
Нажмите кнопки Depth и Time, чтобы подтвердить сбор Z-стека и временных серий. Наконец, нажмите кнопку XY Zt, чтобы начать получение изображений в режиме таймлапс. После завершения съемки нажмите в интерфейсе программного обеспечения кнопку Series Done.
Сохраните изображения в формате OIB для записи снимков и связанных с ними метаданных. На данном рисунке с помощью широкопольной и конфокальной микроскопии показаны органеллы и R-B нейроны, расположенные на поверхности эмбриона. Здесь для отслеживания перемещения отдельной митохондрии в периферическом дендритном дереве R-B нейрона использовалась таймлапс-визуализация на широкопольном микроскопе.
Конфокальная визуализация происходит значительно медленнее, что может привести к недооценке динамики определенных субклеточных событий. Изображения клеток сетчатки, полученные с помощью широкопольной микроскопии, характеризуются низким контрастом, так как флуоресцентные сигналы из большого объема ткани скрывают детали в фокальной плоскости. В данном случае возможность оптического секционирования, присущая конфокальной микроскопии, заметно повышает контрастность.
На врезках показаны детали области внутреннего ядерного слоя с маркировкой клеточных мембран и митохондрий. Благодаря специфическому драйверу Gau-4 сенсорного нейрона, мозаичная экспрессия после инъекций UAS-mito-CFP и UAS MAY-FP позволяет отслеживать отдельные клетки в течение нескольких дней, что продемонстрировано на данном сенсорном нейроне R-B на второй и третий дни после оплодотворения. Помимо митохондрий, флуоресцентную метку можно нанести и на другие субклеточные органеллы, например, на центросомы.
В данном примере две кассеты UAS в составе единого непрерывного конструкта обеспечивали экспрессию YFP, нацеленного на центросомы, и cerulean, нацеленного на мембрану, в клетках сетчатки. На врезках показана клетка в М-фазе. Вся процедура занимает несколько дней, включая скрещивание, сбор яиц, инъекции и, наконец, визуализацию на третий или четвертый день после оплодотворения.
Непосредственно эксперимент по визуализации на микроскопе может занять от нескольких минут до целого дня. После выполнения данной процедуры можно провести маркировку и визуализацию других органелл, таких как микротрубочки или пероксисомы, чтобы изучить их динамику in-vivo. Не забывайте, что PTU является канцерогеном, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, например, использовать перчатки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод визуализации субклеточных органелл, в частности центросом и митохондрий, в живых эмбрионах данио-рерио. Этот метод позволяет исследователям изучать динамику органелл in vivo, что дает представление о физиологических состояниях и патологиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Понимание динамики органелл имеет решающее значение для изучения клеточных функций.
- Изучение этой динамики in vivo дает преимущества по сравнению с традиционными методами.
- Эмбрионы данио-рерио служат моделью для исследований позвоночных.
- Данный метод может быть применен к различным моделям заболеваний, включая болезнь Альцгеймера.
Цель исследования
- Для исследования динамики митохондрий и centroсом в живых организмах.
- Для обеспечения неинвазивного метода изучения субклеточных структур.
- Для углубления понимания поведения органелл в физиологических условиях.
Используемые методы
- Генетическое мечение центросом и митохондрий.
- Широкопольная и конфокальная микроскопия для визуализации.
- Микроинъекции для получения эмбрионов с транзиторной экспрессией.
- Использование раствора Данио с PTU для поддержания жизнеспособности эмбрионов.
Основные результаты
- Успешная визуализация динамики органелл в живых эмбрионах zebrafish.
- Данные о поведении митохондрий и центросом in vivo.
- Потенциальные возможности применения при изучении моделей заболеваний.
- Демонстрация неинвазивного подхода к субклеточной визуализации.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для изучения динамики органелл.
- Он открывает новые возможности для исследований в области биологии нейронов и механизмов развития заболеваний.
- Эту методику можно адаптировать для различных экспериментальных условий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация субклеточных органелл в живых эмбрионах позвоночных позволяет напрямую наблюдать динамические клеточные процессы, важные для валидации мишеней и снижения механистических рисков на ранних этапах поиска лекарственных средств. Модель zebrafish предоставляет целостную, оптически доступную систему для изучения поведения органелл в физиологических условиях, что повышает прогностическую уверенность в модуляции сигнальных путей. Данный подход снижает зависимость от инвазивных моделей млекопитающих и ускоряет проверку гипотез в биологии нейронов и системах, релевантных для изучения заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации динамики митохондрий и centroсом in vivo.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямого наблюдения за поведением органелл в нейрональном контексте.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность выбора мишени, связывая субклеточную динамику с клеточными фенотипами в системе позвоночных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные визуализируемые субклеточные показатели для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимую подготовку меченых эмбрионов для согласованного рабочего процесса визуализации.
- Масштабируемость: Способствует повторному использованию платформы для различных целевых органелл с помощью общей генетической инфраструктуры и средств визуализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между визуализацией органелл на этапе фундаментальных исследований и доклинической валидацией на моделях заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.
- Механистическое снижение рисков: позволяет уточнить вклад субклеточных структур в развитие клеточной дисфункции, связанной с заболеванием.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: предоставляет данные для принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), выявляя динамические ответы органелл на генетические или фармакологические воздействия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска путем предоставления данных с субклеточным разрешением, которые используются на стадиях валидации мишеней и идентификации ведущих соединений, особенно в программах, ориентированных на нейробиологию.
- Открывательная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей посредством прямой визуализации динамики органелл в живых нейронах.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные эмбриональные системы с флуоресцентно мечеными органеллами, готовые к проведению анализа для скрининга соединений.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение транспорта митохондрий и позиционирования центросом в качестве функциональных показателей.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований путем моделирования субклеточной динамики в системах позвоночных, релевантных для изучения заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации, адаптируемую к различным органеллам и типам клеток с помощью системы Gal4-UAS.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности субклеточных функций.
- Операционная ценность: Стандартизирует протоколы подготовки эмбрионов и визуализации для воспроизводимой оценки субклеточной динамики.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннее снижение рисков при работе с мишенями с помощью неинвазивной визуализации позвоночных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем установления связи между поведением органелл и фенотипическими исходами в контексте заболеваний.
Особенности реализации
- Требуются навыки содержания zebrafish, микроинъекций и создания трансгенных линий.
- Необходимы системы флуоресцентной микроскопии с подходящими объективами и камерами контроля окружающей среды.
- Требуется стандартизация процедур определения стадии развития эмбрионов, анестезии и монтирования между исследовательскими группами.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных субклеточных мишеней и специфичных для типов клеток промоторов.
- Существуют практические ограничения, такие как фототоксичность и влияние пигментации, которые минимизируются использованием PTU и методами визуализации при низком освещении.
