Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в автоматическом обнаружении чувствительных к эстрогену клеток у живых личинок рыбок данио. Это достигается путем разведения пяти взрослых рыб X-E-R-E-G-F-P для получения эмбрионов репортеров данио-рерио. Далее эмбрионы помещаются в отдельные лунки 96-луночной пластины.

Затем в пластину эмбрионов добавляются эстрогены. Наконец, пластина сканируется на флуоресценцию с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с моторизованным предметным столиком. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для того, чтобы показать тканевую специфическую активность рецепторов эстрогена.

Таким образом, основное преимущество использования этого метода по сравнению с другими традиционными методами, такими как высокопроизводительный скрининг или скрининг с высоким содержанием, заключается в том, что тканевая специфическая флуоресценция у личинок данио-рерио может быть визуализирована с помощью только стандартного эпифлуоресцентного микроскопа. Оснащен моторизованной сценой, не требует специализированного считывателя пластин. Предостережение: химические вещества с бисфенолом А и эстрадиолом опасны и могут оказывать вредное воздействие на плод человека.

Обращайтесь с эндокринными разрушителями с осторожностью и всегда используйте надлежащие средства индивидуальной защиты. В этой демонстрации рыбки данио будут подвергаться воздействию эстрогенов 17 бета-эстрадиола, бисфенола А и генина в различных дозах, начиная через 48 часов после оплодотворения после разведения рыбок данио, а также собирая и приравнивая икру. Согласно тексту в день обработки развести оттаивающие исходные химические растворы, один к 1000 в одном миллилитре Е трех В плюс вихревой ПТУ энергично.

В качестве пульта управления транспортным средством. Используйте разведение ДМСО в соотношении 1 к 1000 в Е, В, В и ПТУ с использованием пластикового трансфера с большим отверстием. Пипетка переносит три эмбриона из лунки в планшет на 96 лунок, подготавливая три лунки для каждого условия.

Избегайте помещения эмбрионов в наружные лунки, чтобы предотвратить испарение среды при длительном лечении. Работая быстро, чтобы избежать пересыхания зародышей, удалите среду из каждой лунки и добавьте по 200 микролитров хорошо перемешанного лечебного раствора. Визуально подтвердите, что все эмбрионы погружены в раствор и не прилипли к бортику лунки.

Инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия через 72 часа. После оплодотворения обезболите эмбрионы, добавив 10 микролитров четырех миллиграммов на миллилитр трики. К каждому, хорошо поместите пластину на 96 лунок на моторизованную сцену и используйте программное обеспечение Zeiss Zen Blue 2011.

Откалибруйте столик, выбрав вариант носителя образца и выбрав многолуночный 96. Затем выберите «Калибровка», прежде чем следовать пошаговым инструкциям с использованием объектива с 10-кратным увеличением и настройкой яркого поля или BF, определите положительный контрольный эмбрион и установите соответствующие настройки экспозиции для каналов BF и GFP, убедившись, что флуоресцентный сигнал не насыщает камеру. Сосредоточьтесь на одном эмбрионе и запрограммируйте микроскоп на получение в общей сложности трех Z-сечений, которые включают одно изображение на 50 микрометров выше и одно на 50 микрометров ниже текущей фокальной плоскости.

Далее необходимо задать программные параметры для получения мозаичного изображения с использованием каналов GFP и BF. На вкладке Приобретение выберите Расширенная настройка, выберите Области плитки, а затем Плитки. Выберите круг.

Опция Well select carrier and fill factor 90%, чтобы получить несколько изображений выбранных скважин, так что 90% площади каждой скважины будет видно на составном изображении. В разделе «Параметры» выберите желаемую степень перекрытия, например, от пяти до 10%, что обеспечивает плавный стык между изображениями. Затем начните визуализацию для ручной съемки изображений с использованием объектива 20x и настройки BF, определите положительный контрольный эмбрион.

Установите настройки BF и GFP, как и раньше, и сделайте снимки. На этом рисунке представлены составные изображения из отдельных скважин 96-луночной пластины. Каждое изображение состоит из 59 отдельных изображений с наложением изображения на 5%.

Обратите внимание, что живые рыбки данио ориентированы случайным образом внутри каждой лунки. Тем не менее, мы можем отличить флуоресценцию в сердце от флуоресценции в печени. Изображения светлого поля полезны в качестве справочных материалов для оценки ориентации рыбок данио и визуализации морфологических аномалий.

Показанные здесь изображения были получены с помощью объектива с увеличенным в 20 раз рабочим расстоянием для более детального анализа и были сделаны непосредственно после показанного автоматического сканирования, не снимая пластину с предметного столика микроскопа. Используя объектив 20-кратного увеличения, флуоресценцию в сердце можно точно локализовать на предсердных желудочковых клапанах, обозначенных стрелками, и на аортальных клапанах, как указано стрелкой. Как только эта техника будет освоена, в день можно будет получать изображения с 3 96 настенных панелей.

Не забывайте, что работа с соединениями, разрушающими эндокринную систему, может быть опасной, поэтому всегда принимайте надлежащие меры предосторожности, такие как ношение надлежащих средств индивидуальной защиты во время выполнения этой процедуры.