Непосредственное определение характеристик гидратированных белков в воде SALVI и TOF-SIMS

Общая цель данной процедуры заключается в характеристике адсорбированных белковых пленок в водных растворах с использованием системы анализа на границе раздела жидкость-вакуум и времяпролетной вторично-ионной масс-спектрометрии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о биомолекулах и биоинтерфейсах. Например, при характеристике белков, адсорбированных на твердой поверхности.

Основными преимуществами данного метода являются возможность инициации биомолекул in situ в жидкой среде, а также возможность его применения в сочетании с молекулярным картированием. Хотя этот метод позволяет изучать биомолекулы на границе раздела твердой и жидкой фаз, его также можно применять к другим системам, включая исследование отдельных раковых клеток, взаимодействие лекарственных препаратов и прикрепление биопленок. В шприц объемом 5 мл наберите 2 мл 70% раствора ethanol.

Подсоедините шприц к входному концу устройства SALVI и медленно введите 1 мл жидкости в течение 10 минут. По окончании инъекции отсоедините шприц и соедините вход и выход SALVI с помощью полиэфирэфиркетонового соединителя. Выдержите микроканал SALVI, заполненный 70% ethanol раствором, при комнатной температуре в течение четырех часов.

Затем наполните второй шприц стерильной деионизированной водой. Подсоедините его к входному отверстию SALVI и медленно введите деионизированную воду в устройство в течение 10 минут. Извлеките шприц и снова соедините между собой входное и выходное отверстия устройства.

Для иммобилизации белковой пленки начните с набора двух миллилитров раствора фибронектина в шприц. Подсоедините шприц к входному отверстию устройства SALVI и медленно введите один миллилитр жидкости в течение 10 минут. Затем извлеките шприц и снова соедините входное и выходное отверстия.

Инкубируйте установку в чистой чашке для культивирования при комнатной температуре в течение 12 часов. После инкубации медленно введите один миллилитр стерильной деионизированной воды в течение 10 минут, а затем снова соедините вход с выходом. Для начала поместите предметный столик ToF-SIMS на плоскую чистую поверхность.

Поместите устройство SALVI на предметный столик так, чтобы кремниевая пластина и мембрана из нитрида кремния были обращены вверх. Закрепите устройство SALVI на столике с помощью четырех металлических зажимов, прикрутив зажимы, удерживающие углы устройства, к металлической пластине четырьмя винтами. Затем осторожно сверните трубку из ПТФЭ, подключенную к микрофлюидному каналу.

Используйте четыре металлических крепления и четыре винта, чтобы зафиксировать жесткую часть. Убедитесь, что устройство расположено на свободном участке предметного столика так, чтобы оно не препятствовало прохождению первичного ионного пучка во время анализа. Затем с помощью винта установите чашку Фарадея на столик.

Затем откройте дверь шлюза ToF-SIMS и горизонтально установите предметный столик на загрузочную платформу, после чего закройте дверь. Включите вакуумный насос и откачайте камеру шлюза до давления около 10⁻⁶ мбар. Затем, спустя примерно 30 минут, когда вакуум стабилизируется, переместите устройство SALVI в основную камеру.

Отрегулируйте первичный ионный пучок и анализатор ToF-SIMS для достижения пространственного разрешения приблизительно 400 nanometers, следуя протоколу, рекомендованному производителем. Затем найдите микрофлюидный канал с помощью оптического микроскопа. Используйте центр оптического изображения в качестве ориентира и совместите его с центром изображения вторичных ионов.

Визуальная демонстрация этого этапа имеет решающее значение, так как его сложно освоить из-за того, что образец толще обычных твердых образцов, и трудно подобрать настройки для достижения наилучшей фокусировки канала. Перед каждым измерением используйте пучок кислорода с энергией 1 keV для сканирования окна из нитрида кремния в течение примерно 15 секунд, чтобы удалить поверхностные загрязнения. Также используйте электронное пучковое устройство (flood gun) для компенсации заряда поверхности во время всех измерений.

Затем, перед началом сбора данных, выберите положительный или отрицательный режим. Во всех измерениях в качестве первичного ионного пучка используйте ионы висмута Bi³⁺ с энергией 25 keV. Для профилирования по глубине сканируйте первичным ионным пучком круглую область диаметром около 2 мкм с разрешением 32 × 32 пикселя.

Чтобы минимизировать время, необходимое для пробивания мембраны из нитрида кремния, используйте первичный ионный пучок с большой длительностью импульса. После пробивания мембраны из нитрида кремния поддерживайте тот же ток в течение примерно 200 секунд для получения данных, достаточных для двухмерной реконструкции изображений. Для сбора данных уменьшите длительность импульса до 80 nanoseconds, чтобы получить спектры с более высоким массовым разрешением.

Продолжайте сбор данных еще около 200 секунд. С помощью микрофлюидного интерфейса SALVI первичный ионный пучок может напрямую воздействовать на гидратированную пленку фибронектина. Данные масс-спектрометрии ToF-SIMS указывают на наличие ряда водных кластеров и фрагментов аминокислот.

Это служит прямым доказательством свойств молекул воды, окружающих гидратированные молекулы белка и находящихся внутри них. Здесь представлен временной ряд профилей глубины гидратированной пленки фибронектина и деионизированной воды. Интенсивность выбранных вторичных ионов ничтожно мала до момента пробития мембраны из нитрида кремния.

После пробития мембраны из нитрида кремния интенсивность вторичных ионов значительно возрастает. Процесс с короткой длительностью импульса используется для получения данных с более высоким разрешением по массе для реконструкции изображений и спектров. 2D-изображения гидратированной пленки фибронектина и деионизированной воды представляют собой количество зарегистрированных выбранных вторичных ионов из образца.

Чем ярче изображение, тем выше число вторичных ионов. Такие наглядные изображения позволяют четко сравнить выбранные вторичные ионы в разных образцах, что облегчает анализ данных. При выполнении данной процедуры важно помнить, что перед установкой в вакуумную камеру микрореактор должен быть полностью герметичен.

Эта методика открыла исследователям в области биологии и биоинтерфейсов путь к изучению адсорбции белков, прикрепления биопленок, самоорганизующихся монослоев и многих других явлений. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как исследовать различные жидкие образцы с помощью SALVI и жидкостного ToF-SIMS.