Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

Общая цель этого метода FINA, который расшифровывается как фильтрационное выделение нуклеиновых кислот, заключается в том, чтобы быстро и просто выделить геномную ДНК для амплификации ПЦР из сложных образцов без использования лабораторных приборов, таких как центрифуга. Этот метод экспресс-экстракции ДНК на основе бумаги для провирусной ДНК ВИЧ был разработан для включения в диагностическое устройство для количественной ПЦР. Основное преимущество этого метода заключается в том, что модули подготовки образцов и ПЦР-пробирки могут быть подготовлены заранее, поэтому экстракция ДНК занимает менее двух минут.

Впервые мы разработали этот метод, чтобы включить его в выборку для ответа на ранний диагностический тест на ВИЧ-1 у младенцев из крови пяточной палочки. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что удаление подложки двусторонней ленты, которая удерживает мембрану захвата клеток сбоку от ПЦР-пробирки, требует практики. Демонстрировать процедуру будет Джен Рид, старший техник из моей лаборатории.

Начните эту процедуру с подготовки материалов, необходимых для сборки модуля подготовки образцов FINA. Подготовьте промокательную бумагу, вырезав квадрат 35 на 35 миллиметров из 100% ватного диска толщиной 2,6 миллиметра. Подготовьте полиэтиленовую парафиновую пленку с бумажной подкладочной лентой.

Отрежьте кусок парафиновой пленки размером 25 на 50 мм, а затем с помощью молотка проделайте отверстие диаметром 7,14 мм в центре ленты. Подготовьте мембрану сепаратора крови из связанного стекла или захватывающий диск, пробивая с помощью молотка круг диаметром 8,35 мм. Для сборки модуля пробоподготовки FINA с помощью щипцов поместите захватывающий диск в центр промокательной салфетки.

Снимите подложку из парафиновой пленки и поместите ее на диск захвата так, чтобы вся парафиновая лента осталась открытой в центре диска для захвата. Обеспечьте максимальный контакт между диском и промокательной салфеткой, слегка растянув парафиновую ленту, чтобы покрыть промокательную салфетку, и плотно прижав парафиновую ленту, чтобы приклеить ее к промокательной салфетке по всем краям диска. Для крепления мембраны захвата к боковой стороне пробирки для количественной ПЦР требуется ленточный диск диаметром 5,1 мм, чтобы предотвратить блокирование мембраной флуоресцентного детектирования прибора для ПЦР в реальном времени.

Подготовьте этот диск для ленты, используя молоток, чтобы пробить круг диагностической ленты из полиэстера с двойным покрытием из листа ленты. С помощью щипцов снимите с одной стороны ленту наклейку вкладыша. Поместите ленту в ПЦР-пробирку объемом 200 микролитров, приклеив ее с одной стороны и к дну пробирки.

Снимите вторую подкладку для наклеек. Теперь трубка готова к приему подготовленного диска. В этом видео будет продемонстрировано обнаружение провирусной ДНК из цельной крови, содержащей 8e5 LAV-клеток.

Разморозьте ранее замороженные гранулы ячейки 8e5 LAV на льду. Готовят серийное разведение клеток в замораживающей среде с концентрацией от 1 до 400 клеток на микролитр. Пипеткой наберите по 10 микролитров клеток из каждого из разведений в микроцентрифужную пробирку.

Добавьте 100 микролитров свежего образца цельной крови, обработанного ВИЧ-1, в каждую пробирку, чтобы создать стандартную кривую. Перемешайте, осторожно щелкнув дном трубки пять раз. Чтобы начать процедуру экстракции ДНК, лизируйте клетки крови, добавив тритон X-100 до конечной концентрации в один процент.

Перемешайте, осторожно щелкнув дном трубки пять раз. Кровь должна стать полупрозрачной красной. Нанесите весь образец крови пипеткой на диск для захвата.

Водонепроницаемое уплотнение между парафиновой лентой и захватной мембраной обеспечивает протекание крови через мембрану. А хороший контакт между контактной мембраной и промокательной губкой в сборе обеспечивает быстрое впитывание пробы. Дайте образцу пропитаться через фильтр.

Лизат крови впитался в диск захвата, и диск становится матовым. Добавьте от 600 до 1 000 микролитров 10 ммоль гидроксида натрия по каплям на диск захвата. Фильтр изменится с красного на белый, указывая на клиренс гемоглобина.

Далее отделите диск от промокательной салфетки и приложите диск к ленте в подготовленной ПЦР-пробирке. После того, как фильтр будет помещен в ПЦР-пробирку, сразу же проанализируйте образец. Приготовьте мастер-смесь для количественной ПЦР, как описано в тексте протокола, и убедитесь, что фильтр полностью покрыт мастер-смесью и остается неподвижным на боковой стороне пробирки на протяжении всей реакции.

Выполните амплификацию с помощью устройства для ПЦР в реальном времени, как описано в тексте протокола. В качестве альтернативы, если кПЦР не может быть выполнена, немедленно просушите фильтр в течение ночи в боксе, содержащем влагопоглотитель сульфата кальция. На следующий день закройте крышкой и поместите ПЦР-пробирку в фольгированный пакет с осушителем диоксида кремния и храните при комнатной температуре до тех пор, пока не будете готовы к анализу.

Этот метод позволяет эффективно амплифицировать провирус ВИЧ-1 из клеток 8e5 LAV с различным числом копий. Сплошные линии представляют собой графики амплификации, полученные из четырех реплик ВИЧ-1-отрицательной цельной крови, содержащей 4000, 400, 40 и 10 8e5 LAV-клеток с 500 копиями на реакцию внутреннего контроля. Пунктирной линией обозначен порог.

На следующем графике показаны стандартные кривые значений цикла количественного анализа, рассчитанные на основе графика амплификации vs. log числа копий 8e5 LAV клеток на 100 микролитров цельной крови. Расчетная эффективность ПЦР составила 103%Реплики стандартной кривой провирусной ДНК ВИЧ также обладают высокой воспроизводимой амплификацией.

Кроме того, наличие внутреннего контроля 500 копий гидроксипируватредуктазы показывает, что не происходит ингибирования ПЦР в результате экстракции крови этим методом, независимо от количества присутствующих копий провируса ВИЧ-1. Сплошные линии представляют графики усиления, а пунктирная линия представляет пороговое значение. После этой процедуры мишени ПЦР могут быть амплифицированы из различных типов образцов для обнаружения интересующего вас гена.

Например, мазки из щек для фармакогенетического скрининга или кровь для быстрого генотипирования животных моделей. Не забывайте, что работа с патогенами, передающимися через кровь, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать универсальные меры предосторожности.