Электричество-Free, последовательное нуклеиновых кислот и белков изоляции

Общая цель данной процедуры заключается в выделении нуклеиновых кислот, готовых для ПЦР, и иммунореактивного белка из образца без необходимости использования электроэнергии или лабораторной инфраструктуры. Выделение нуклеиновых кислот и белков начинается со смешивания образца с гуанидином и тиоцианатом для лизиса образца и пропускания смеси через сорбент в экстракционной пипетке. После пятого и финального прохождения через сорбент перенесите смесь в буфер для экстракции белков и отставьте для последующего выделения иммунореактивного белка.

Затем сорбент и связаные нуклеиновые кислоты промывают, пропуская через сорбент 95% ethanol. После этого сорбент и связаные нуклеиновые кислоты несколько раз высушивают, обдувая сорбент окружающим воздухом в течение пяти минут. Заключительным этапом выделения нуклеиновых кислот, готовых к ПЦР, является элюирование нуклеиновых кислот из сорбента с использованием 250 µL tris или другого аналогичного водного раствора для выделения иммунореактивного белка.

После смешивания образца и буфера для экстракции белков с помощью второй экстракционной пипетки пропустите смесь через сорбент 15 раз. На следующем этапе необходимо промыть сорбент с иммобилизованным белком, несколько раз пропустив через него 95% ethanol. Затем сорбент и связанный белок высушивают, продувая сорбент комнатным воздухом в течение пяти минут.

Заключительным этапом протокола является элюция белка из сорбента. В конечном итоге, экстракционная пипетка, используемая в данной процедуре, позволяет проводить выделение нуклеиновых кислот, готовых для ПЦР, и иммунореактивного белка без использования электричества. Здравствуйте, меня зовут Дейв Павловски.

Я старший научный сотрудник компании Kubrick Incorporated в Буффало, штат Нью-Йорк. Сегодня мы изучим методику, которая позволяет изолировать как белки, так и нуклеиновые кислоты последовательно, без необходимости использования центрифуги, вортекса или любого другого дополнительного лабораторного оборудования. Перед лизисом образцов убедитесь, что они находятся в жидкой форме. Если образец твердый, например, пищевой продукт или кал, его следует суспендировать в жидкой среде, такой как вода или фосфатно-солевой буферный раствор.

Смешайте 500 µL образца с 500 µL 6 M гуанидинтиоцианата в пробирке объемом 1,5 мл. Затем нажмите на грушу экстракционной пипетки, вытесняя из нее окружающий воздух. Медленно отпустите грушу, чтобы втянуть весь образец объемом 1 мл в экстракционную пипетку через абсорбирующий материал.

Переверните инструмент для экстракции так, чтобы сорбент и образец стекли в колбу. Перетрите сорбент вместе с образцом в колбе, стараясь не вытолкнуть образец из экстракционной пипетки.

Переверните экстракционную пипетку и вытесните образец обратно в исходную пробирку объемом 1,5 мл. Наберите весь образец объемом 1 мл в экстракционную пипетку, пропуская его через сорбент с умеренной скоростью. Осторожно удерживая сорбент в горлышке экстракционной пипетки, вытесните весь образец в пробирку объемом 1,5 мл, нажав на грушу.

Повторите этот процесс, пропуская образец через сорбент еще четыре раза, чтобы в общей сложности получилось пять прохождений. После пятого прохождения через сорбент перенесите весь образец объемом 1 мл в 4 мл буфера для экстракции белка в конической пробирке объемом 15 мл. Перемешайте содержимое пробирки путем инверсии, затем закройте пробирку и отставьте ее до дальнейшего использования.

Промойте выделенные нуклеиновые кислоты, трижды пропустив один миллилитр 95% ethanol через сорбент, возвращая этанол в исходную пробирку. После этого повторите промывку трижды, используя второй миллилитр 95% ethanol. Следующим этапом процедуры является высушивание сорбента; восстановление нуклеиновых кислот лучше всего проводить, когда сорбент полностью высох.

Я понимаю, что этот этап утомителен. Однако если вы выполните его в рекомендованный промежуток времени, результаты будут лучше. Нажимайте и отпускайте грушу в течение пяти минут.

Пропускайте окружающий воздух через экстракционную пипетку для высушивания нуклеиновых кислот и слоя сорбента, затем удалите остатки этанола с кончика экстракционной пипетки. Используя салфетку Kimwipe, вымойте нуклеиновые кислоты, пять раз пропустив через сорбент 250 µL 10 mM Трис-буфера. Трис-буфер можно заменить любым другим подходящим водным раствором, например PBS.

Полученный раствор содержит экстрагированные нуклеиновые кислоты. Для того чтобы сначала провести экстракцию белков, смешайте образец с буфером для экстракции белков, который был отложен ранее, переворачивая пробирку. Пропустите примерно 2–3 мл этого образца объемом 5 мл через сорбент новой экстракционной пипетки. Вытолкните весь образец в ту же коническую пробирку объемом 15 мл, стараясь сохранить сорбент в горлышке экстракционной пипетки.

Повторите этот процесс, пропуская образец через сорбент 15 раз. Промойте сорбент и связанный белок, пропустив через слой сорбента один миллилитр 95%Ethanol три раза, сбрасывая этанол в исходную пробирку; промойте еще три раза, используя второй миллилитр 95%ethanol.

Следующим этапом процедуры является повторное высушивание сорбента. Как и в случае с нуклеиновыми кислотами, восстановление белков лучше всего проводить при высушивании сорбента в течение более длительного периода времени.

Нажимайте и отпускайте грушу в течение пяти минут, пропуская окружающий воздух через экстракционную пипетку. Чтобы высушить слой сорбента для белков, удалите остатки этанола с кончика экстракционной пипетки. С помощью салфетки Kim wipe элюируйте белок, пропуская через сорбент 250 µL PBS пять раз.

Буфер PBS можно заменить любым другим подходящим водным раствором, например, 10 мМ Tris (pH 6,8). Полученный раствор содержит белковый компонент образца. Гены шига-токсина, связанные со штаммом entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven E DL 9 33, были амплифицированы после процедуры экстракции нуклеиновых кислот и белков с использованием экстракционного дозатора.

Гены шига-токсина, шига-токсин 1 и шига-токсин 2, расположены на умеренных lambda-подобных бактериальных фагах и дефектных бактериальных фагах под контролем промотора PR. Активация SOS-ответа в e coli приводит к индукции профага и/или выработке токсина. В данном случае при индукции SOS-ответа митомицином C наблюдается значительное увеличение амплификации гена шига-токсина 2 по сравнению с необработанным контролем.

Это указывает на индукцию профага и репликацию генома фага. Белок, полученный в результате экспериментов по выделению нуклеиновых кислот и белков, описанных в видео, обладает иммунореактивностью. Выделенная фракция белка была нанесена на полоски для экспресс-анализа методом латерального потока на E. coli O 157.

Контроли демонстрируют положительную идентификацию во всех образцах, содержащих e coli oh 1 5 7, с индукцией или без индукции shiga toin, что визуализируется наличием двух красных полос. Данные также показывают положительные результаты для тех образцов, содержащих e coli oh 1 5 7, в которых выделение нуклеиновых кислот и белков проводилось с использованием экстракционной пипетки. Эти данные свидетельствуют о том, что изолированный белок из каждого образца является иммуноактивным и, следовательно, вызывает положительный ответ.

Выделенный белок пригоден для электрофореза, что показано здесь на 8% акриламидном геле с окрашиванием кумаси, в который был внесен BSA, выделенный из шестимолярного гудина изотиоцианата. При использовании данного метода экстракции, дозирования и соответствующего протокола электрофоретическая подвижность выделенного белка идентична подвижности контрольных образцов. После освоения данной методики вы сможете выполнять эту процедуру менее чем за 20 минут.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как выделять белки и нуклеиновые кислоты с помощью этого простого устройства. Благодарим вас за время, потраченное на просмотр нашего видео.