Обнаружение рН-зависимой активности

Общая цель данных анализов шаперонов in vivo и in vitro заключается в характеристике pH-зависимой активности шаперона Escherichia coli HdeB в условиях кислого pH. Кислотоактивированные шапероны выполняют одну задачу: они должны защищать белки от индуцированного кислотой разворачивания и деградации. Эта функция особенно важна для энтеробактерий, которые должны выжить в кислой среде желудка, чтобы успешно колонизировать кишечник.

Методы, которые мы представляем здесь, позволяют идентифицировать и охарактеризовать кислотоактивируемые шапероны, а также определить условия pH, которые приводят к их активации. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как проводить характеристику шаперонов, таких как HdeB, in vitro и in vivo, что поможет вам расшифровать механизм их активации. Эти методы были успешно применены и для других кислотозащитных шаперонов, таких как HDA, и могут быть дополнительно модифицированы для работы с другими шаперонами и/или условиями стресса.

Изучается влияние очищенного HdeB на агрегацию подвергающейся термическому разворачиванию митохондриальной малатдегидрогеназы свиньи при различных значениях pH. Диализ MDH проводят при температуре 4 °C в течение ночи против четырех литров буфера C. Затем белок концентрируют примерно до 100 µM с помощью центрифужных фильтрующих устройств с пределом отсечения по молекулярной массе 30 kDa. Для удаления агрегатов белок центрифугируют в течение 20 минут при 20 000 ×g и температуре 4 °C.

Определите концентрацию MDH по абсорбции при 280 нм. Затем приготовьте аликвоты MDH по 50 µL и подвергните их flash-заморозке для хранения. Поместите кварцевую кювету объемом 1 мл в флуоресцентный спектрофотометр, оснащенный термостатируемыми держателями для образцов и перемешивателями.

Установите длину волны возбуждения и регистрации на 350 нанометров. Добавьте в кювету соответствующие объемы предварительно нагретого буфера D с заданными значениями pH. Общий объем составляет 1 000 микролитров.

Установите температуру в кюветодержателе на 43 °C. Добавьте 12.5 µM HdeB в буфер, затем добавьте 0.5 µM MDH. Начните мониторинг светорассеяния.

Инкубируйте реакционную смесь в течение 360 секунд, чтобы обеспечить достаточное развертывание MDH. Доведите pH до семи, добавив от 0,16 до 0,34 объема двухмолярного небуферизованного дикалийфосфата, и продолжайте регистрацию светорассеяния еще в течение 440 секунд. Проанализируйте данные согласно текстовому протоколу.

Трансформируйте штамм BB7224 Delta RPOH плазмидой, экспрессирующей HdeB, или векторным контролем MD, PBAD 18, используя химически компетентные клетки. Данный штамм чувствителен к температуре, поэтому его необходимо культивировать при 30 °C. После теплового шока при 42 °C в течение 45 секунд и перед высевом на чашки инкубируйте клетки при 30 °C и 200 RPM.

Выполните высев положительных клонов единичными колониями и инкубируйте их в течение ночи при 30 degrees Celsius. Подготовьте ночную культуру в 50 milliliters среды LB с ампициллином и культивируйте клетки при 200 RPM и 30 degrees Celsius. Разведите ночные культуры в 40 раз в 25 milliliters среды LB с ампициллином.

Культивируйте бактерии в присутствии 0,5% арабинозы при 30 °C и 200 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нм (OD 600), равной 1,0, для индукции экспрессии белка HDEB. Для экспериментов со сдвигом pH используйте среду LB с ампициллином и арабинозой, чтобы разбавить клетки до OD 600 равной 0,5. Доведите среду до соответствующих значений pH, добавляя подходящие объемы пятимолярной соляной кислоты.

По истечении указанных промежутков времени нейтрализуйте культуры, добавив соответствующие объемы пятимолярного гидроксида натрия. Контролируйте рост нейтрализованных культур и жидкой культуры в течение 12 часов при 30 °C, измеряя OD. Чтобы исследовать оптимальное значение pH для шаперонной активности HdeB in vitro, нативную MDH разводили в предварительно нагретом буфере с указанным значением pH в присутствии или отсутствие HdeB.

После 360 секунд инкубации агрегация MDH при 43 °C была инициирована путем нейтрализации. В присутствии HdeB сигнал светорассеяния при нейтрализации от pH 4 значительно снижается, что указывает на то, что HdeB препятствует агрегации MDH. Измерения агрегации очень чувствительны к изменениям температуры или состава буфера.

Для исключения ложноположительных результатов было изучено влияние буфера для хранения шаперона на агрегацию клиента. Буфер для хранения HdeB не оказал влияния на агрегацию MDH. Чтобы изучить эффекты HdeB in vivo, были проведены анализы выживаемости в зависимости от pH с использованием температурно-чувствительного штамма с делецией RPOH.

Этот штамм лишен большинства шаперонов и, следовательно, более чувствителен к повышенной температуре, низкому pH или окислительному стрессу. Оверэкспрессия HdeB в условиях нейтрального pH не оказала влияния на скорость роста штамма, который рос сопоставимо с контрольным штаммом, содержащим пустой вектор PBAD 18. Напротив, были обнаружены явные различия в их способности возобновлять рост после воздействия pH three или pH four: штамм с оверэкспрессией HdeB демонстрировал воспроизводимо более быстрое восстановление после воздействия низкого pH по сравнению с контрольным штаммом.

После освоения метода очистка может быть выполнена за три дня, анализ рассеяния in vitro — за один день, а тесты на выживаемость in vivo — за два дня при условии правильного проведения процедур. При выполнении этих экспериментов необходимо тщательно продумать дизайн исследования, учитывая тип клиентных белков, их концентрации и используемые буферные условия. Основным преимуществом данного метода является возможность получить более детальное понимание механизма активации шаперонов и их эффектов в контексте in vivo.

И не забывайте, что изучение pH-оптимума кислотозащитного шаперона может быть довольно сложной задачей. Это связано с тем, что поведение клиента-белка, который вы используете, скорее всего, также будет меняться в зависимости от pH. Поэтому обязательно выбирайте такие буферные системы, которые подходят как для шаперона, так и для клиента-белка.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализ осаждения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в условиях седиментации (SCS page), для автоматического количественного определения подавления агрегации субстрата под действием шаперонов.