Adenofection: метод изучения роли молекулярных шаперонов в клеточных морфодинамики истощением-спасательных экспериментов

Общая цель данного метода заключается в том, чтобы обеспечить возможность проведения экспериментов по восстановлению после истощения (depletion rescue) в условиях, сохраняющих целостность клеток и белковый гомеостаз для функционального анализа биологических процессов на уровне отдельных клеток.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся функций белков и структурных требований в процессах клеточной динамики, таких как митоз и дифференцировка клеток. Основным преимуществом этой методики является возможность истощения запасов целевого белка с одновременным введением его варианта на уровне, близком к физиологическому, в большинстве клеток популяции.

Начните с покрытия чашек со стеклянным дном фибронектином. Для этого разведите стоковый раствор фибронектина с концентрацией 1 mg/mL в стерильном PBS в соотношении 1:100.

Добавьте по 1 мл в каждую чашку объемом 35 мл, чтобы полностью покрыть поверхность. Инкубируйте в течение одного часа при 37 °C и 5% CO2. Во время инкубации предварительно нагрейте до 37 °C среду alpha MEM с добавлением 10% FBS и аликвоту 0,05% трипсина-ЭДТА.

После 45 минут инкубации начните подготовку клеточной суспензии. Аспирируйте среду из 10-сантиметровой чашки с клетками HeLa-RFP-H2B. Затем осторожно промойте их дважды 1.5 миллилитрами 0.05% раствора трипсина-ЭДТА.

Оставьте на планшете 0.5 milliliters трипсина-EDTA после последнего аспирирования и инкубируйте клетки в течение двух-трех минут при 37 °C и 5% CO2.

Осторожно постучите по планшету и осмотрите клеточный слой под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки открепились. Затем добавьте 10 milliliters среды и осторожно пропипетируйте несколько раз для разделения клеток, после чего перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 milliliter.

Подсчитайте количество клеток в пробе суспензии объемом 10 µL с помощью гемоцитометра. Затем аспирируйте раствор фибронектина из планшетов со стеклянным дном. Не допускайте высыхания фибронектина до посева клеток.

Приготовьте суспензию клеток для посева из расчета 1,5 × 10⁵ клеток на чашку диаметром 35 мм в 2 мл среды. Посейте одну дополнительную чашку диаметром 35 мм сверх количества условий для подсчета числа клеток перед трансдукцией вирусом. Инкубируйте в течение 30–45 минут. По истечении времени инкубации проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они хорошо разошлись, как показано здесь. Верните чашки в инкубатор и культивируйте клетки до следующего дня.

На следующий день после посева убедитесь, что плотность клеток достигла как минимум 50%. Плотность клеток ниже 50% приводит к снижению эффективности трансдукции вирусом, увеличению вариабельности экспрессии белка на одну клетку и повышению цитотоксичности. Затем соберите клетки из дополнительной посеянной чашки, как описано ранее, и подсчитайте их количество. Рассчитайте объем вирусов, необходимый для эффективной трансдукции клеток. Маркируйте микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл для каждого условия и добавьте 400 µL подогретой среды alpha MEM minus. После медленного размораживания аликвот вирусов на льду добавьте требуемый объем каждого вируса в пробирки и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Затем, после аспирации среды из чашек с клетками, осторожно добавьте вирусную смесь по каплям. Инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO2. В течение одного часа каждые 15 минут осторожно встряхивайте планшеты в стерильном боксе, чтобы вирус равномерно покрыл клетки. Использование небольшого объема среды облегчает контакт вируса с клетками.

После инкубации осторожно внесите пипеткой 1,6 milliliters среды alpha MEM minus в каждую лунку, чтобы получить общий объем 2 milliliters. Затем начните синхронизацию клеток, добавив 2 millimolar тимидина, после чего инкубируйте клетки еще в течение двух часов.

Тем временем приготовьте смесь для трансфекции siRNA, добавив в микропробирку 139 µL стерильной воды, 50 µL 1 M хлорида кальция и 11 µL 20 µM siRNA. Если siRNA не требуется, замените ее объем стерильной водой для проведения холостой трансфекции. Медленно, по каплям, добавьте раствор HBSS-2X к смеси хлорида кальция и siRNA. Аккуратно перемешайте дважды путем вдувания воздуха с помощью пипетки на 200 µL, так как более мелкие преципитаты обеспечивают более высокую эффективность трансфекции. Затем инкубируйте смесь в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации медленно добавьте по 200 µL смеси по каплям в каждую лунку и перемешайте путем встряхивания. Инкубируйте планшеты при 37 °C и 5% CO2 в течение 16 часов.

На следующий день извлеките планшеты из инкубатора и перенесите их в ламинарный шкаф для культивирования тканей. После двукратного промывания клеток двумя миллилитрами теплого HEPES добавьте два миллилитра alpha MEM minus, после чего верните планшеты в инкубатор.

Спустя семь часов добавьте в лунки тимидин в концентрации 2 мМ, после чего верните их в инкубатор. Работайте не более чем с четырьмя планшетами с клетками одновременно, так как колебания температуры влияют на продолжительность клеточного цикла. На следующий день, через 48 часов после трансфекции siRNA и вирусного заражения, дважды промойте клетки 2 мл теплого PBS, затем добавьте 2 мл среды alpha MEM без фенолового красного для визуализации живых клеток. Инкубируйте в течение семи часов.

Проведите эксперименты по краткосрочной визуализации живых клеток в митозе с использованием инвертированного микроскопа, оснащенного терморегулируемой камерой с увлажнением и содержанием 5% carbon dioxide. Перед началом регистрации данных убедитесь, что в камере достигнута необходимая температура 37 degrees Celsius.

Поместите чашки с культурой в камеру микроскопа за один час до начала регистрации данных, чтобы обеспечить надлежащее уравновешивание среды и избежать дрейфа фокуса из-за температурных изменений. Оцените митотическое состояние клеток. На данном этапе от 10 до 15% клеток должны находиться на ранних стадиях митоза.

Во время времени уравновешивания установите параметры сбора данных, определенные в предыдущих экспериментах. Важно добиться соответствующего разрешения без фотообесцвечивания, так как оно вызывает повреждение клеток и нарушает протекание митоза. Для каждого условия выберите несколько полей, содержащих клетки на стадии вступления в митоз, чтобы получить значительное количество клеток для анализа, не превышая интервал сбора данных. После выбора всех полей заново настройте фокус и как можно быстрее начните сбор данных.

При использовании конфокальной системы со сканирующим диском типичная схема эксперимента будет включать четыре различных условия, семь полей обзора на планшет и два цветовых канала с интервалом от 1.5 до двух минут в течение 75 минут. Определите четкие критерии для анализа митотических фенотипов в клетках, которые будут зависеть от используемых флуоресцентных маркеров.

В отличие от трансфекции BAG3-GFP плазмидной ДНК, представленной слева, аденофекция рекомбинантными аденовирусами, показанная справа, обеспечивает более гомогенную и эффективную экспрессию BAG3-GFP в большинстве популяции клеток при низкой множественности заражения. Данный репрезентативный вестерн-блот демонстрирует, что аденофекция специфическими siRNA к BAG3 и рекомбинантным аденовирусом BAG3-GFP позволяет эффективно истощить запасы эндогенного BAG3 и реинтродуцировать белок BAG3-GFP на уровнях, близких к эндогенным. Как показано здесь, аденофекция может сохранять белковый гомеостаз, так как в аденофектированных клетках HeLa не обнаруживается значимого повышения уровней стресс-индуцированных белков теплового шока, в отличие от клеток HeLa, обработанных индуктором протеотоксического стресса MG132. Здесь мы видим, что прохождение клеток через митоз не нарушается существенно при аденофекции, что подтверждается данными конфокальных тайм-лапс изображений клеток HeLa, аденофектированных контрольной siRNA, а также BacMam-GFP alpha Tubulin и BacMam-RFP Actin.

На графике показана доля клеток с аномальным митозом. В клетках, трансфицированных только специфической siRNA к BAG3, наблюдалось примерно двукратное увеличение уровня митотических дефектов (красный столбец), который восстанавливался почти до уровня контрольных клеток при повторном введении BAG3-GFP (черный столбец).

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить эксперименты по спасению при делеции с использованием аденофекции. Этот метод представляет собой быструю и простую систему создания гипоморфных нокдаунов для анализа зависимости структуры от функции в различных клеточных средах. Следуя данному методу, можно определить ключевые структурные требования к исследуемому белку для обеспечения определенной функции. Для более детального изучения задействованных механизмов затем могут быть использованы другие подходы к редактированию генома.