Количественная оценка поглощения микроглии синаптическим материалом с помощью проточной цитометрии
31 мая 2024 г.
В данной работе мы представляем два протокола для количественной оценки поглощения микроглией vGLUT1-положительных синапсов и сырых синаптосом, меченных красным цветом pHRodo, с помощью проточной цитометрии.
Наши исследования сосредоточены на психонейроиммунологии, и мы изучаем перекрестные связи иммунной системы с мозгом и разумом. Меня особенно интересует расшифровка подгрупп пациентов на основе их иммунного статуса, чтобы найти для них индивидуальное лечение. Последние разработки в нашей области включают, например, разработку ПЭТ-лигандов, а также передовые технологии, такие как секвенирование РНК, секвенирование РНК одиночных клеток и пространственное секвенирование РНК для расшифровки иммунотерапии.
Наш протокол решает проблему количественной оценки поглощения микроглии синаптическим материалом, что имеет решающее значение для понимания роли в функционировании мозга, а также в патологии заболеваний. Наш протокол обеспечивает быструю и надежную количественное определение поглощенного синаптического материала микроглией и, следовательно, дает представление о функциональной активности микроглии. Наш протокол вдохновит другие исследовательские группы на включение в свои исследования более функциональных анализов, таких как поглощенные мотосинаптосомы, и это приведет к лучшему и более всестороннему пониманию роли микроглии в нейроиммунных взаимодействиях.
Обзор
В данном исследовании представлены протоколы измерения микроглиального поглощения синапсов, положительных по vGLUT1, и грубых синаптосом, меченных pHRodo Red, с помощью проточной цитометрии. Исследование сосредоточено на изучении роли микроглии в функционировании мозга и патологии заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Проточная цитометрия
Теоретические сведения
- Микроглия играет ключевую роль в нейроиммунных взаимодействиях.
- Поглощение синаптического материала имеет решающее значение для понимания функций микроглии.
- Последние достижения в таких технологиях, как секвенирование РНК, способствуют разработке методов терапии на основе иммунного ответа.
- Понимание иммунного статуса пациентов необходимо для подбора индивидуального лечения.
Цель исследования
- Для количественной оценки поглощения микроглией синаптического материала.
- Для стимулирования внедрения функциональных анализов в исследования микроглии.
- Для получения новых данных о роли микроглии в функциях мозга и развитии заболеваний.
Используемые методы
- Для оценки поглощения микроглией использовали проточную цитометрию.
- В качестве основной биологической модели использовали ткани диссоциированного гиппокампа мыши.
- Протоколы включали различные этапы центрифугирования и окрашивания для изоляции и анализа клеток.
- Ключевые этапы включали фильтрацию, окрашивание на CD16/CD32 и детектирование VGLUT1.
- Микроскопия и проточная цитометрия были необходимы для анализа флуоресцентных сигналов.
Основные результаты
- В микроглии гиппокампа наблюдались более высокие уровни флуоресцентного сигнала VGLUT1-PE по сравнению с изотипическим контролем.
- Отмечены различия в интенсивности флуоресценции в различных областях мозга.
- Данный метод позволил надежно количественно оценить активность микроглии, связанную с синаптическим материалом.
Выводы
- В данном исследовании разработан метод количественного определения поглощения синапсов микроглией.
- Полученные результаты расширяют понимание нейроиммунных взаимодействий и роли микроглии при нормальном состоянии и патологиях.
- Полученные данные могут привести к созданию новых подходов к изучению влияния микроглии на нейронные механизмы.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка поглощения микроглией синаптического материала имеет решающее значение для снижения рисков при выборе нейроиммунных мишеней и выяснения механизмов, лежащих в основе синаптической перестройки в моделях заболеваний. Описанные методы анализа на основе проточной цитометрии позволяют проводить высокопроизводительное и воспроизводимое измерение функции микроглии, что повышает прогностическую достоверность в портфелях ранних открытий и трансляционной нейробиологии. Оптимизированная количественная оценка ускоряет функциональную валидацию и позволяет принимать обоснованные решения о продвижении программ разработки нейроиммунных терапевтических средств с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональный анализ активности микроглии при синаптическом ремоделировании в моделях нейродегенеративных и нейропсихиатрических заболеваний.
- Способствует снижению биологических рисков, предоставляя количественные данные о способности микроглии к фагоцитозу в различных областях мозга.
- Облегчает механическую валидацию мишеней, связывая функцию иммунных клеток с исходами синаптических изменений.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает масштабируемую высокопроизводительную альтернативу методам анализа фагоцитоза на основе визуализации для скрининга соединений или генетического скрининга.
- Обеспечивает стандартизированные количественные результаты, подходящие для воспроизводимости между различными исследованиями и центрами.
- Позволяет проводить быструю оценку потенциальных модуляторов функции микроглии in vitro и in vivo.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям патологических заболеваний за счет количественной оценки активности микроглии в конкретных областях мозга и в условиях патологии.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя разрабатывать функциональные биомаркеры.
- Предоставляет трансляционные данные о нейроиммунных механизмах, вовлеченных в синаптическую патологию.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод количественного анализа на основе проточной цитометрии интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, связывая ранние механистические исследования с разработкой трансляционных биомаркеров в области нейроиммунологии.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о синаптическом прунинге, опосредованном микроглией, и о взаимодействии между иммунной системой и мозгом.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели поглощения для исследований влияния химических соединений или генетических модификаций.
- Аналитика: предоставляет данные на основе флуоресцентных измерений, позволяющие проводить статистическое сравнение активности микроглии при различных условиях.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию с моделями заболеваний и стратегиями поиска функциональных биомаркеров.
- Корпоративное использование: предлагает повторно используемый стандартизированный рабочий процесс, который можно адаптировать к различным программам нейроиммунологических исследований.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации нейроиммунных мишеней и снижении механистических рисков.
- Операционная ценность: сокращает время проведения анализа и трудозатраты, повышая пропускную способность и воспроизводимость.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и проводить сортировку портфеля на основе функциональных показателей микроглии.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации нейроиммунных активов с учетом рисков и развитию инициатив по поиску трансляционных биомаркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области проточной цитометрии и выделения нейроиммунных клеток.
- Необходим доступ к высококачественному цитометрическому оборудованию и аналитическому программному обеспечению.
- Стандартизация стратегий окрашивания и гейтирования имеет решающее значение для воспроизводимости результатов между различными исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных отделов головного мозга или моделей заболеваний.
- Чувствительность и специфичность анализа зависят от качества антител и подготовки образцов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:36
In Vivo Quantification of Microglial Engulfment of Glutamatergic Synapses with Intracellular vGLUT1 Staining
4:27
Flow Cytometric Quantification of In Vitro Microglial Engulfment of Crude Synaptosomes for the Analysis of Synaptic Refinement
