Количественная иммуногистохимия клеточного микроокружения при резекции глиобластомы пациента
31 июля 2017 г.
Этот протокол был разработан для количественного определения компонентов микроокружения опухоли при резекциях пациентов с глиобластомой с использованием хромогенной иммуногистохимии и ImageJ.
Общая цель этого протокола заключается в количественной идентификации компонентов микроокружения опухоли при резекции пациента с глиобластомой с использованием хромогенной иммуногистохимии и изображения J. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроокружения опухоли, например, как эти компоненты выглядят в образцах пациентов и как мы можем определить физиологически значимые соотношения клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она проста для анализа в образцах пациентов. Применение этого метода распространяется на выяснение недостаточно охарактеризованного, сложного микроокружения опухоли глиобластомы.
Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что время хромогенного развития необходимо тщательно контролировать, чтобы предотвратить чрезмерное развитие и насыщение ткани. Начните протокол с выполнения промывок, указанных в сопроводительном текстовом протоколе. Разбавить демаскирующий раствор антигена высокого pH на основе триса и дистиллированную воду в соответствии с рекомендациями производителя.
Перейдите к извлечению антигена, опосредованного нагреванием, добавив разбавленный демаскирующий раствор в негерметичный сосуд для микроволновой печи. Поместите в сосуд горки. Затем поместите сосуд с горками в микроволновую печь.
Далее прокипятите сосуд в течение 20 минут на высокой мощности. Следите за уровнем испарения жидкости и при необходимости пополняйте емкость дистиллированной водой. Дайте образцам остыть в растворе в течение одного часа при комнатной температуре.
Обведите образец ткани гидрофобным средством, чтобы свести к минимуму объем реагентов, необходимых для покрытия образца. Затем нанесите достаточное количество раствора для пермеабилизации, от 100 до 200 микролитров, чтобы покрыть образец ткани. Удалите и выбросьте раствор и снова покройте образец ткани раствором для пермеабилизации.
Инкубируйте образцы при комнатной температуре с блокирующим раствором в течение одного часа. Затем инкубируйте образцы в течение ночи при четырех градусах Цельсия с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе. На следующий день обнаруживают первичные антитела с помощью полимерного реагента пероксидазы хрена, соответствующего животному-хозяину с первичным антителом.
Нанесите внутрь достаточное количество раствора для пермеабилизации, чтобы покрыть образец ткани, и инкубируйте образец в течение пяти минут. Удалите и выбросьте раствор и покройте образец ткани раствором для пермеабилизации еще раз на пять минут. Инкубируйте предметные стекла в 0,3%-ной перекиси водорода и IX TBS в течение 15 минут.
Проявляйте образцы с помощью пероксидазы диаминобензидина или субстрата dab в течение двух-10 минут до достижения желаемой интенсивности окрашивания. Для идентификации ядра клеток проведите контрокрашивание образцов, например, гематоксилином, следуя протоколу производителя. Обезвоживайте образцы с помощью 100% этанола и ксилола.
Наконец, закрепите образцы на постоянной основе с помощью монтажного носителя. Две области, представляющие интерес в наших резекциях опухолей, первичная опухоль Bulk и прилегающие области, в основном состоящие из здоровой ткани с диффузными вторгшимися раковыми клетками, были идентифицированы сотрудничающим невропатологом на образцах пациентов, окрашенных гематоксилином и эозином. Хромогенная иммуногистохимия выявила положительное окрашивание астроцитов, микроглии и олигодендроцитов в каждом образце пациента.
Мы проводили окрашивание без первичных антител для отрицательного контроля. Производитель рекомендовал дальнейшие разведения, прежде чем остановиться на разведении от 1 до 200 в связи с оптимальным положительным окрашиванием клеточного тела и процессом с минимальным фоном для антитела против ALDH 1l1. Используя изображение J, был количественно определен процент покрытия OSP-1 положительным окрашиванием олигодендроцитов, чтобы в конечном итоге сравнить различия в интересующих нас регионах.
После того, как соответствующий порог был применен к изображению, процент покрытия от порога может быть измерен и сравнен для нескольких пациентов. Пять смежных и объемных областей образцов пациентов с глиобластомой или ГБМ, а также здоровая ткань мозга сравнивались на предмет покрытия первого белка, специфичного для олигодендроцитов, или процентного охвата OSP1. После освоения техника окрашивания может быть выполнена за четыре часа в первый день и за два часа во второй день, если она выполнена правильно.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательном контроле интенсивности окрашивания тканей и увлажненности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод количественного определения компонентов микроокружения опухоли в резекциях глиобластомы пациентов с использованием хромогенного иммуногистохимического анализа и программы ImageJ. Этот метод предназначен для получения детального представления о сложном микроокружении глиобластомы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Гистология
Теоретическая часть
- Глиобластома представляет собой крайне агрессивную опухоль головного мозга.
- Микроокружение опухоли играет решающую роль в ее прогрессировании.
- Понимание состава этой среды необходимо для разработки методов таргетной терапии.
- Хромогенная иммуногистохимия позволяет детально визуализировать компоненты ткани.
Цель исследования
- Для количественной оценки микроокружения опухоли в образцах глиобластомы.
- Для определения физиологически значимых соотношений различных типов клеток.
- Для обеспечения простого метода анализа образцов пациентов.
Используемые методы
- Хромогенное иммуногистохимическое окрашивание тканей.
- Программное обеспечение ImageJ для количественного анализа.
- Протоколы промывки и демаскировки антигенов в соответствии с рекомендациями производителя.
- Тщательный контроль времени хромогенного проявления.
Основные результаты
- Успешная идентификация различных компонентов микроокружения опухоли.
- Разработка методов определения соотношения типов клеток в образцах глиобластомы.
- Представление данных о сложности микроокружения глиобластомы.
- Демонстрация применимости метода к образцам пациентов.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения микроокружения глиобластомы.
- Он способствует пониманию взаимодействий внутри микроокружения опухоли.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для совершенствования стратегий лечения глиобластомы.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественный анализ микроокружения опухоли в образцах глиобластомы, полученных от пациентов, позволяет снизить механистические риски при выборе мишеней в глиальных клетках в процессе поиска нейроонкологических препаратов. Обеспечивая воспроизводимые, регионоспецифические измерения астроцитов, микроглии и олигодендроцитов, данный метод способствует валидации мишеней и фенотипическому скринингу в системах, релевантных заболеванию. Он повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, связывая состав микроокружения с терапевтическим ответом и механизмами резистентности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать фенотипы глиальных клеток и их функциональные состояния в гетерогенных областях опухоли.
- Практическая ценность: обеспечивает количественные результаты на основе изображений для оценки взаимодействия с мишенью и модуляции микроокружения.
- Прогностическая ценность: способствует подбору мишеней на основе биомаркеров путем корреляции содержания глиальных клеток с патологическими градиентами в образцах пациентов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Устанавливаются стандартизированные протоколы иммуногистохимии, совместимые с конвейерами высокопроизводительной визуализации и анализа.
- Количественные результаты: С помощью ImageJ рассчитываются показатели процента покрытия, которые позволяют проводить сравнения между образцами и регионами.
- Воспроизводимость: Определяются критические временны́е параметры хромогенного проявления для обеспечения специфичности сигнала и минимизации фонового шума.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: использование образцов резекции реальных пациентов для сохранения патофизиологической достоверности в исследованиях по валидации мишеней.
- Трансляционная преемственность: связь результатов поисковых исследований с доклиническими моделями путем определения количественных критериев состава глиальных клеток.
- Снижение рисков: уменьшение неопределенности при биологическом обосновании терапии, направленной на глию, за счет характеристики контекста микроокружения.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез относительно мишеней до оптимизации соединений-лидеров, что особенно актуально для программ в области нейроонкологии, направленных на модуляцию микроокружения.
- Биология открытий: способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет обеспечения пространственного и количественного профилирования популяций глии в тканях человека.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные, количественно определяемые паттерны окрашивания, которые могут быть использованы для оценки влияния соединений на состав микроокружения.
- Аналитика: обеспечивает измерения процента покрытия на основе пороговых значений, что позволяет проводить статистическое сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: согласуются со стратегиями поиска биомаркеров путем установления связи между плотностью глиальных клеток и гистопатологическими областями интереса.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает переносимый рабочий процесс IHC/ImageJ, применимый для моделей глиомы и других опухолей ЦНС.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность выбора мишени за счет количественного пространственно-разрешенного анализа глиальных клеток в образцах пациентов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам демаскировки антигенов, блокировки и времени проявления.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения неопределенности в вопросах взаимодействия с микроокружением мишени.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию средств терапии, модулирующих глию, с учетом рисков на основе данных о взаимодействии с микроокружением.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммуногистохимии и обращения с нейропатологическими образцами.
- Результат зависит от оптимизации времени хромогенного проявления для предотвращения насыщения сигнала.
- Необходимы стандартизированные протоколы пороговой обработки в ImageJ для обеспечения согласованности количественного анализа.
- Требуется доступ к образцам резекций глиобластомы пациентов с аннотированными интересующими областями.
- Метод ограничен гетерогенностью тканей и необходимостью проведения регионального анализа для исключения искажающих сигналов.
