На основе массива сравнительной геномной гибридизации платформа для эффективного обнаружения копии номер вариации в быстро нейтрон-индуцированной Люцерна truncatula мутантов

Общая цель этого протокола сравнительной геномной гибридизации на основе массива состоит в том, чтобы быстро идентифицировать вариации числа копий у индуцированных бомбардировкой быстрыми нейтронами мутантов бобового растения Medicago truncatula. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы в области биологии бобовых культур. Например, облегчение идентификации эмпатогенов на низком участке, участвующих в регуляции развития клубеньков у бобовых.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он имеет высочайшую репутацию и чувствителен в обнаружении вариаций числа копий, таких как делеционные мутации в мутантах нейтронной бомбардировки бобового растения Medicago truncatula. Демонстрировать эту процедуру буду я и Хунчэн Ванг, главный врач из генетической лаборатории. Быстро заморозьте один грамм молодой ткани листьев, собранной с отдельных растений, в жидком азоте.

Затем используйте ступку и пестик и измельчите замороженную ткань листьев до мелкого порошка в жидком азоте. Извлеките образцы геномной ДНК дикого типа и мутантного генома из мелкого порошка с помощью набора для выделения ДНК. Используйте центрифужные пробирки объемом 500 микролитров, чтобы разбавить по одному микрограмму ДНК каждого дикого типа и мутантных геномных ДНК с двойной дистиллированной водой до конечного объема 20 микролитров.

Затем добавьте пять микролитров случайного праймера в пробирки центрифуги. Быстро сделайте трубки вихревыми и после быстрого отжима поместите их в термоамплификатор на 10 минут, чтобы денатурировать образцы ДНК при температуре 98 градусов по Цельсию. Через 10 минут извлеките трубки из термоамплификатора, и мгновенно поместите их в ледяную воду на пять минут.

Затем приготовьте две смеси для мечения и добавьте 25 микролитров смеси для мечения в виде одного и двух в пробирки дикого типа и мутантной ДНК соответственно. Пипеткой смешайте ДНК и мечение три раза, а затем кратковременно закрутите пробирки. После отжима инкубируйте пробирки в термоамплификаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, а затем при 65 градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы инактивировать фермент экзо Кленоу.

Затем добавьте 430 микролитров One X TE Buffer и смешайте содержимое в каждой пробирке. Далее кратко закрутите пробирки и перенесите раствор в пробирках в очистные колонны с двумя миллилитровыми сборными пробирками. Центрифугируйте очистные колонны при 14 000 умноженных на G в течение 10 минут и отбросьте поток.

Добавьте 480 микролитров One X TE Buffer в каждую колонку и снова центрифугируйте при 14 000 G в течение 10 минут. Откажитесь от сквозного потока. Перенесите каждую из меченых ДНК дикого типа и мутантных ДНК со дна колонки в новые центрифужные пробирки.

После измерения объема каждой из меченых ДНК с помощью пипетки отрегулируйте конечный объем до 80 микролитров с помощью One X TE Buffer, затем измерьте концентрацию меченых ДНК в спектрофотометре. Затем смешайте эквивалентные объемы ДНК мутантного и дикого типов для гибридизации зондов на микрочипе для сравнительной гибридизации. Доведите окончательный объем до 160 микролитров с помощью One X TE Buffer.

Далее приготовьте раствор для гибридизации и трижды пипетируйте его, чтобы хорошо смешать три агента со смешанной ДНК. После кратковременного вращения трубок инкубируйте их в термоамплификаторе при температуре 98 градусов Цельсия в течение 10 минут, и при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут. Не забудьте установить температуру на 67 градусов по Цельсию, чтобы разогреть печь для гибридизации за четыре часа до гибридизации.

Затем поместите на основание камеры гибридизации предметное стекло и загрузите на него 490 микролитров гибридизационного раствора после 20 минут инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в термоамплификаторе. Для формирования камеры гибридизации накройте предметное стекло прокладкой микрочипом генома Medicago truncatula, затем накройте камеру гибридизации и надежно затяните ее зажимами. Инкубируйте собранную гибридизационную камеру в гибридизационной печи при температуре 67 градусов Цельсия в течение 40-48 часов.

Тем временем приготовьте две горки для мытья посуды с 250 миллилитрами буфера для мытья при комнатной температуре. Затем сделайте одну скользящую миску для мытья с буфером для мытья номер два, чтобы температура составляла 37 градусов по Цельсию. Затем приготовьте одну банку для мытья предметных стекол с 70 миллилитрами ацетонитрила, а другую банку для мытья предметных стекол с 70 миллилитрами стабилизирующего и волочного раствора.

Поместите обе горки для мытья банок в вытяжной шкаф при комнатной температуре. После инкубации выньте камеру гибридизации из печи для гибридизации и ослабьте зажимы камеры, чтобы открыть крышку. Затем снимите микрочип на предметной прокладке и поместите их на горку для мытья посуды с помощью Wash Buffer One.

Изолируйте микрочип от затвора крышки. Затем перенесите микрочип на вторую миску для мытья слайдов с помощью Wash Buffer One. С помощью мешалки аккуратно перемешайте раствор на магнитной пластине для перемешивания при комнатной температуре в течение пяти минут.

Поместите микрочип на скользящую форму для мытья с предварительно нагретым буфером для стирки, затем перемешайте с помощью мешалки, чтобы смыть раствор при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты. Извлеките микрочип и поместите его в банку для стирки предметных стекол, содержащую ацетонитрил, в вытяжном шкафу для мытья в течение 30 секунд. Перенесите микрочип в банку для мойки слайдов со стабилизирующим и сушильным раствором и снова промойте в течение 30 секунд.

Осторожно удалите скол и высушите в течение одной минуты внутри вытяжного шкафа. Отсканируйте микрочип с помощью сканера с разрешением два микрометра. Программное обеспечение для картирования сигналов было использовано в качестве интерфейса для анализа распределения нормализованных log two отношений мутантных и диких сигналов по восьми хромосомам.

Для предполагаемых делеций учитывается величина отношения log two, равная или меньше минус двух целых пять десятых пятого стандартного отклонения. Сегментационный анализ программного обеспечения демонстрирует область делеции примерно в 22 килооснования на четвертой хромосоме, показанной на графике. Анализ границ делеции, окруженных микроматричными зондами, показывает сниженное среднее нормализованное отношение log two.

На графике также показаны шесть других аннотированных генов, включая дочерний ген, охватывающий удаленную область. Ген Son отвечает за контроль клубеньков у Metecago truncatula. Затем ПЦР-амплификация, проведенная для подтверждения границ делеции, показывает продукт в одну целую пять килооснований, амплифицированный из мутанта FN6191, но не в диком типе.

Секвенирование ДНК было проведено для того, чтобы показать делеционный узел у мутанта FN6191, показанный черной стрелкой. Также было проведено секвенирование, которое подтвердило расположение границ удаления. После освоения этой техники ее можно выполнить за 72 часа, если она выполнена правильно.

Чтобы получить данные высокого качества, не забывайте поддерживать низкую концентрацию озона в помещении, где проводится процедура. После этой процедуры могут быть выполнены другие измерения, такие как полимеразные цепные реакции секвенирования генома, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как размер и количество копий в геноме. Событие и валидация этого метода проложили путь исследователям к изучению вариаций числа копий, которые они вызывают у мутантов, и естественных вариантов у видов растений, которые не поддаются инсерционному мутагенезу, таких как Garden P. Не забывайте, что работа с ацетонитрилом, стабилизацией и сушкой раствором может быть чрезвычайно опасной.

Меры предосторожности, такие как ношение глазных защитных приспособлений, избегание прямого контакта с агентами и тщательная работа, абсолютно необходимы.