Конфокальная томография двуцепочечной РНК и шаблон признание рецепторов в отрицательной смысл РНК вируса
26 января 2019 г.
Двуцепочечной РНК производится во время репликации РНК вируса могут быть признаны рецепторов признание шаблон побудить врожденный иммунный ответ. Для отрицательных смысл РНК-вирусов взаимодействие между низкоуровневых двуцепочечной ДНК и РРСС остается неясным. Мы разработали метод confocal микроскопии для визуализации Аренавирусы двуцепочечной ДНК и ПРР в отдельных клетках.
Традиционные двойной нити РНК обнаружения анализа, как правило, не является достаточно чувствительным для обнаружения двухструны РНК формируется в негативном смысле РНК вирусной инфекции. Поэтому взаимодействие между двухструйными РНК и рецепторами распознавания образов хозяина остается в значительной степени неуловимым для этих вирусов. Используя этот протокол, мы можем визуализировать и охарактеризовать взаимодействие между вирусным ядерным белком, двухструйной РНК и принимать ОРВ на одноклеточном уровне для вируса РНК негативного смысла. Это мультиплексный анализ, который позволяет одновременное окрашивание двухместной РНК и двух вирусных или принимающих белковых мишеней в отдельных клетках. В отличие от анализа РНК-ФИШ, этот метод является РНК-последовательностью независимой и обычно совместим с обнаружением антител белковых целей. Начните за 24 часа до заражения, посев 200 000 человеческих легких эпителиальных клеток A549 на Поли-D-лизин покрытием стеклянной крышкой скользит в 12-хорошо пластин и выращивая их на 37
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается распознавание двухцепочечной РНК (дцРНК), образующейся при репликации РНК-содержащих вирусов, рецепторами распознавания паттернов (PRRs) для индукции врожденного иммунного ответа. Основное внимание уделено вирусам с отрицательной полярностью РНК, при которых взаимодействие между низким уровнем дцРНК и PRRs изучено недостаточно. Был разработан метод конфокальной микроскопии для визуализации дцРНК аренавирусов и PRRs в отдельных клетках.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Вирусология
Теоретические сведения
- Двуцепочечная РНК является побочным продуктом репликации РНК-содержащих вирусов.
- Рецепторы распознавания паттернов играют ключевую роль врожденного иммунного ответа.
- Взаимодействие между dsRNA и PRR при инфекции РНК-вирусами с отрицательной полярностью изучено недостаточно.
- Визуализация dsRNA и PRR может способствовать более глубокому пониманию механизмов уклонения вирусов от иммунного ответа.
Цель исследования
- Выяснить характер взаимодействия между dsRNA и PRRs в РНК-вирусах с отрицательной полярностью.
- Разработать метод визуализации этих взаимодействий в отдельных клетках.
- Внести вклад в понимание врожденного иммунного ответа на РНК-вирусы.
Используемые методы
- Конфокальная микроскопия для визуализации дцРНК и PRR.
- Клеточные анализы для оценки иммунного ответа.
- Анализ уровней дцРНК в процессе вирусной репликации.
- Сравнительные исследования с различными РНК-содержащими вирусами.
Основные результаты
- Успешная визуализация дцРНК аренавируса и PRR в отдельных клетках.
- Идентификация специфических взаимодействий между дцРНК и PRR.
- Понимание механизмов иммунного ответа, запускаемого дцРНК.
- Разъяснение роли дцРНК в патогенезе вируса.
Выводы
- Разработанный метод конфокальной микроскопии эффективен для изучения взаимодействий между dsRNA и PRR.
- Понимание этих взаимодействий может привести к созданию новых терапевтических стратегий борьбы с РНК-содержащими вирусами.
- Данное исследование вносит вклад в более широкую область вирусной иммунологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация низкокопийной двухцепочечной РНК (дцРНК) при инфекции РНК-вирусами с отрицательной полярностью позволяет восполнить критический пробел в понимании механизмов активации врожденного иммунитета и иммунного ускользания вирусов. Эта возможность способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при поиске противовирусных препаратов, позволяя напрямую наблюдать взаимодействие рецепторов распознавания паттернов (PRR) с репликативными интермедиатами вирусов. Данный метод повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней на ранних этапах разработки препаратов против аренавирусов и родственных патогенов, что помогает определить приоритеты портфеля в программах по изучению патогенов с высоким уровнем биологической опасности.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации взаимодействий dsRNA-PRR с одноклеточным разрешением на моделях патогенных вирусов.
- Практическая ценность: обеспечивает высокочувствительный, не зависящий от последовательности метод детекции, совместимый с мультиплексным окрашиванием белков для выяснения сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков при выборе мишеней PRR путем подтверждения связывания лиганда в соответствующих контекстах инфекции.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать количественные, пространственно разрешенные данные о колокализации dsRNA и PRR для стандартизации анализа.
- Значимость для скрининга: подготавливает валидированные биологические системы для последующего скрининга соединений путем установления базовых показателей иммунной активации.
- Полезность платформы: совместима с методами детекции на основе антител, что позволяет повторно использовать систему для различных вирусных мишеней и белков хозяина в рабочих процессах визуализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь между результатами фундаментальных исследований и доклинической валидацией путем картирования распределения dsRNA и привлечения PRR в системах, релевантных заболеванию.
- Механистическое понимание: проясняет пространственную и временную динамику сигналинга врожденного иммунитета, что позволяет обосновать выбор биомаркеров для модуляции путей передачи сигнала.
- Прогресс с учетом рисков: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе визуального подтверждения взаимодействия с мишенью в моделях с высокой патогенностью.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез относительно мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической валидации, особенно для иммуномодулирующих противовирусных препаратов, воздействующих на пути PRR.
- Биология открытий: поддерживает проверку гипотез о механизмах действия агонистов/антагонистов PRR посредством визуализации dsRNA как эндогенного лиганда в инфицированных клетках.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации, позволяющие сравнивать влияние различных соединений на взаимодействие dsRNA-PRR.
- Аналитика: обеспечивает мультиплексные флуоресцентные считывания (dsRNA, вирусный белок, PRR) для высококонтентного анализа состояний иммунной активации.
- Трансляционные исследования: связывают наблюдения in vitro с доклиническими исследованиями, подтверждая активацию PRR в моделях эпителия легкого, полученных из первичных клеток или стволовых клеток.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную платформу визуализации, применимую к нескольким РНК-вирусам с отрицательной полярностью и мишеням хозяина, помимо аренавирусов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в взаимодействиях между PRR и лигандом.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость анализа благодаря стандартизированным протоколам конфокальной микроскопии и чувствительному детектированию dsRNA.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя прямые визуальные доказательства модуляции сигнального пути, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию иммуномодулирующих кандидатов с учетом рисков на основе подтвержденного взаимодействия с мишенью в контексте патогенных вирусов.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией, иммунофлуоресцентным окрашиванием и методами вирусологии, соответствующими уровню биологической безопасности.
- Зависит от наличия высокочувствительных антител к dsRNA (например, клон 9D5) и совместимой инфраструктуры для флуоресцентной визуализации.
- Необходима стандартизация между лабораториями для обеспечения согласованного количественного определения сигнала dsRNA и анализа колокализации.
- Необходимо учитывать вариабельность клеточных моделей (например, A549 в сравнении с первичным эпителием дыхательных путей) в отношении продукции dsRNA и уровней экспрессии PRR.
- Практические ограничения включают возможную перекрестную реактивность антител и необходимость оптимизации условий в лабораториях с высоким уровнем изоляции (BSL-3/BSL-4).
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
