Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус
23 декабря 2020 г.
Здесь мы описываем простой метод, который сочетает в себе РНК флуоресценции на месте гибридизации (РНК-ФИШ) с иммунофторесценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК. Этот протокол может повысить понимание молекулярных характеристик взаимодействий РНК-хозяина SARS-CoV-2 на одноклеточном уровне.
Этот протокол позволил визуализировать РНК SARS-CoV-2 в клеточных линиях и в полностью дифференцированных трехмерных культурах эпителия дыхательных путей человека, предоставив инструмент для лучшего понимания патогенеза и репликации вируса на уровне отдельных клеток. Благодаря своей высокой специфичности, чувствительности и разрешающей способности этот метод полезен не только для фундаментальных научных исследований SARS-коронавируса-2, но и для прикладных проектов, таких как диагностика. Демонстрировать процедуру будет Агнешка Зудер, аспирант из моей лаборатории.
После фиксации и пермеабилизации ячеек, как описано в рукописи текста, удалите из лунок раствор 1X PBS и добавьте в каждую лунку не менее 300 микролитров амплификационного буфера. Инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Подготовьте каждую шпильку HCR путем мгновенного охлаждения нужного объема в отдельных пробирках.
Для приготовления 300 микролитров раствора для амплификации используйте по 18 пикомолев каждой шпильки. Перелейте раствор шпильки в пробирки, и инкубируйте их при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд. Затем остудить до комнатной температуры в течение 30 минут в темноте.
Приготовьте смесь для шпилек, добавив охлажденные шпильками H1 и H2 в буфер для усиления. Нанесите капли от 30 до 50 микролитров смеси шпилек на Парапленку. Поместите покровные стекла с ячейками на капли шпилечной смеси и инкубируйте образцы в течение ночи в темноте при комнатной температуре.
Чтобы установить предметные стекла, поместите две капли монтажного материала объемом 10 микролитров на предметное стекло, убедившись, что капли отделены друг от друга достаточно, чтобы на одном предметном стекле можно было разместить два покровных стекла. Удалите лишнюю жидкость, постучав покровными стеклами по чистому полотенцу. Затем поместите их в монтажную среду, препятствующую выцветанию, ячейками вниз.
Поместите установленные образцы на сухую плоскую поверхность в темноте и дайте им застыть. После фиксации и пермеабилизации клеток НАО, как описано в рукописи текста, предварительно амплифицируйте образцы путем их инкубации с амплификационным буфером в течение 30 минут при комнатной температуре. С помощью 30 пикомолев каждой шпильки приготовьте 500 микролитров раствора для амплификации.
Перелейте раствор шпильки в трубки, и инкубируйте их при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд. Затем остудите их до комнатной температуры в течение 30 минут в темноте. Приготовьте раствор для шпилек, добавив все охлажденные шпильки в 500 микролитров амплификационного буфера при комнатной температуре.
Удалите раствор для предварительного усиления и добавьте весь раствор для шпильки. Затем инкубируйте образцы в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Поместите вырезную мембрану из вставок Transwell на 10 микролитров монтажной среды с защитой от выцветания ячейками вверх и добавьте дополнительную монтажную среду к мембране.
Затем накройте мембраны покровными стеклами. Этот протокол иммуно-РНК-FISH был проведен в двух клеточных системах: клеточной линии Vero и 3D-культуре эпителия дыхательных путей человека. Показана локализация субгеномной РНК SARS-коронавируса-2 в инфицированных и ложно инокулированных клетках Vero.
Вирусная РНК может быть видна красным цветом. Показана локализация субгеномной РНК SARS-коронавируса-2 в инфицированных и ложно инокулированных эпителиальных клетках дыхательных путей человека. Протокол пермеабилизации был оптимизирован в клетках Vero.
Пермеабилизация с помощью детергента приводит к четкому, специфическому сигналу для субгеномной РНК SARS-коронавируса-2, в то время как использование этанола приводит к размытому и несфокусированному изображению. При монтаже предметных стекол с ячейками Vero важно разместить покровное стекло ячейками вниз. При монтаже предметных стекол HAE мембрану необходимо размещать клетками вверх.
Этот метод может быть легко модифицирован для обнаружения любых РНК, включая некодирующие РНК и РНК-вирусы, которые могут появиться в будущем. В сочетании с иммунофлуоресценцией он может быть использован для изучения взаимодействий белка и РНК на уровне отдельных клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол проведения гибридизации с цепной реакцией (HCR) in situ в сочетании с иммунофлуоресценцией для визуализации РНК SARS-CoV-2 как в клеточных линиях, так и в трехмерных (3D) культурах эпителия дыхательных путей человека. Этот метод обеспечивает высокоспецифичное и чувствительное обнаружение вирусной РНК с разрешением до одной клетки, что способствует изучению патогенеза вируса, его репликации и взаимодействий между вирусом и хозяином.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Молекулярная биология
- Вирусология
- Клеточная биология
- Иммунофлуоресцентная визуализация
Теоретические сведения
- Понимание локализации и репликации SARS-CoV-2 на клеточном уровне имеет решающее значение для изучения патогенеза вируса.
- Традиционные методы детекции РНК могут обладать недостаточной чувствительностью или специфичностью в сложных тканевых средах.
- Реакция гибридизационной цепи (HCR) усиливает сигналы РНК, улучшая детекцию in situ.
- Сочетание HCR с иммунофлуоресценцией позволяет одновременно визуализировать мишени РНК и белков.
Цель исследования
- Предоставить надежный протокол для детекции РНК SARS-CoV-2 в клеточных линиях и 3D-культурах эпителия дыхательных путей.
- Обеспечить картирование вирусной инфекции и репликации с высоким разрешением на уровне отдельных клеток.
- Способствовать изучению взаимодействий между вирусом и хозяином с помощью комбинированной детекции РНК и белков.
Используемые методы
- Фиксация и пермеабилизация клеток и 3D-культур.
- Применение зондов со сплит-инициаторами и шпилек HCR для усиления РНК-сигнала.
- Инкубация в течение ночи с флуоресцентно мечеными амплифицирующими шпильками.
- Заключение образцов в среду с антифейдинговым агентом для конфокальной микроскопии.
- Оптимизация протоколов пермеабилизации для различных типов клеток (детергент против этанола).
- Сочетание с иммунофлуоресценцией для одновременного детектирования белковых мишеней и РНК.
Основные результаты
- Успешная визуализация субгеномной РНК SARS-CoV-2 как в клеточных линиях Vero, так и в 3D-культурах эпителия дыхательных путей человека.
- Пермеабилизация с использованием детергентов обеспечила четкие и специфичные сигналы РНК, в то время как методы на основе этанола привели к более низкому качеству изображений.
- Наблюдалась ничтожная фоновая флуоресценция, что свидетельствует о высокой специфичности и чувствительности метода.
- Протокол может быть адаптирован для детектирования других типов РНК, включая некодирующие РНК и новые РНК-содержащие вирусы.
Выводы
- Протокол гибридизационной цепной реакции (HCR) с иммунофлуоресцентным окрашиванием позволяет проводить чувствительную и специфическую детекцию вирусной РНК в сложных клеточных системах.
- Данный метод позволяет проводить углубленные исследования репликации вирусов, патогенеза и ответов хозяина с разрешением на уровне отдельных клеток.
- Этот метод универсален и может быть модифицирован для диагностических целей или детекции различных РНК-мишеней.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация РНК SARS-CoV-2 с высоким разрешением как в клеточных линиях, так и в 3D-культурах эпителия дыхательных путей человека позволяет точно картировать репликацию вируса и взаимодействия между хозяином и патогеном на уровне отдельных клеток. Эта возможность способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней в процессах исследования инфекционных заболеваний. Адаптируемость данного протокола для различных РНК-мишеней делает его многократно используемым инструментом для быстрого реагирования на возникающие вирусные угрозы.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать репликацию и локализацию вируса в физиологически релевантных системах.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней взаимодействия вируса с хозяином с разрешением на уровне одной клетки.
- Способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет дифференциации специфических событий инфицирования от фонового сигнала.
- Предоставляет достоверные данные для отбора и приоритизации противовирусных мишеней и путей.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели при детекции вирусной РНК в анализах на основе клеточных культур.
- Поддерживает стандартизацию и воспроизводимость анализов в различных клеточных линиях и 3D-культурах.
- Позволяет осуществлять мультиплексную детекцию РНК и белковых мишеней для проведения комплексного скрининга.
- Позволяет создать стабильные биологические системы для последующей оценки воздействия соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям дыхательных путей, релевантным конкретным заболеваниям, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Позволяет картировать инфекционный процесс и ответ хозяина в доклинических тканевых системах.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, предоставляя прогностические данные на уровне отдельных клеток.
- Способствует поиску биомаркеров за счет одновременной визуализации РНК и белков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол иммуно-РНК-FISH охватывает все этапы: от первичного поиска до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез, валидацию мишеней и согласование трансляционных биомаркеров.
- Открывающая биология: обеспечивает высокоспецифичное обнаружение вирусной РНК для выяснения механизмов воздействия и снижения биологических рисков.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные результаты для разработки анализа и скрининга соединений.
- Аналитика: позволяет проводить измерения с разрешением до одной клетки и мультиплексный считываемый анализ для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает модели in vitro и ex vivo для доклинической валидации инфекции и ответа хозяина.
- Корпоративное повторное использование: адаптируема для обнаружения любой РНК, что поддерживает быстрое развертывание средств борьбы с новыми патогенами.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях вирусного патогенеза.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы высокочувствительного мультиплексного детектирования на различных биологических моделях.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежной валидации мишеней.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по созданию противовирусных препаратов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с передовыми методами флуоресцентной микроскопии и гибридизацией in situ.
- Необходим доступ к платформам конфокальной визуализации и валидированным реагентам для амплификации.
- Требуется межкомандная стандартизация для обеспечения воспроизводимости результатов на моделях клеток и тканей.
- Метод адаптируема к различным мишеням РНК при условии оптимизации протокола для новых систем.
- Результат зависит от тщательного проведения пермеабилизации и заключения образцов на предметности и четкости сигнала.
