Полуколичественный препарат affinity Ответственный Целевой стабильности (DARTS) спросить для изучения Rapamycin / mTOR взаимодействия
27 августа 2019 г.
В этом исследовании мы расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве образцового случая.
Лекарственное сродство реагировать целевой стабильности, DARTS, является надежным методом для обнаружения новых малых молекул белка целей. Он может быть использован для проверки известных взаимодействий мало-молекулы белка и найти потенциальные цели белка для натуральных продуктов. В этом исследовании мы еще больше расширить возможности анализа данных эксперимента DARTS путем мониторинга изменений в стабильности белка и оценки сродства белково-лигандовых взаимодействий.
Белково-лигандовые взаимодействия могут быть построены против двух кривых, протеолитической кривой и кривой зависимости от дозы. Мы использовали взаимодействие mTOR-рапамицин в качестве образцового случая для создания нашего протокола. Выращивайте 293T-клетки с помощью DMEM с 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота, двухмилимолянным глутамином и 1%антибиотиками.
Инкубировать культуры при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислого газа. Когда культура достигает 80 до 90% слияния, мыть клетки дважды с холодной PBS. Используйте сотовый скребок, чтобы собрать клетки в соответствующее количество холодного буфера лиза клетки и передать лизирование клеток в 1,5-миллиметровую трубку.
Инвертировать, чтобы смешать буфер лиза и лизирование клеток хорошо и инкубировать трубку на льду в течение 10 минут. Центрифуга трубки при 18 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и держите охлажденным на льду.
Выполните анализ BCA, чтобы приблизить концентрацию белка лисатов и рассчитать разбавление проназ на основе концентрации белка. Во-первых, перенесите лизат в две 1,5-миллилитровые трубки по 99 микролитров каждая. Добавьте один микролитер раствора мелкокаликулярного бульона к каждой алициту лизата и инкубировать две трубки в течение 30-60 минут при комнатной температуре при встряхивании.
На льду устанавливают серийные разбавления свежеоттая проназного раствора в 1x ТНК. После инкубации с небольшой молекулой, разделить каждый aliquot на 20 микролитров образцов в пяти трубках. Чтобы обеспечить одинаковое время пищеварения, через определенные промежутки времени каждые 30 секунд, добавьте два микролитера подготовленных проназных растворов в образцы соответственно.
Для одной контрольной группы добавьте два микролитера буфера ТНК. Через 5-20 минут, остановить переваривание шести труб через добавление двух микролитров холодного 20x ингибитора протеазы коктейль с 30-секундными интервалами. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 10 минут.
Разбавить каждый образец шестью микролитров 5x SDS-PAGE загрузки буфера и варить образцы в водяной бане при 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Теперь, для выполнения западной помарки, загрузите равное количество белка в скважины геля 8%SDS-PAGE, а также соответствующий молекулярный маркер веса. Запустите гель в течение 30 минут на 80 вольт, затем отрегулируйте напряжение до 120 вольт и продолжайте работать в течение одного-двух часов.
Убедитесь, что небольшая молекула может связываться непосредственно с потенциальными белками-мишенями. В этом протоколе инкубация с небольшой молекулой подтвердила защиту от протеолиза. Было установлено, что три группы защищены инкубацией рапамицином для управления транспортным средством.
Западные blotting проиллюстрировали при наличии белка mTOR при низких соотношениях проназ к белку и его уменьшение и потерю с увеличением соотношения. Протеолиз mTOR проназой был явно ингибируется наличием рапамицина и добавление рапамицина вызвало очевидный сдвиг в протеолитической кривой. Доза рапамицина зависит от повышения уровня mTOR, что свидетельствует о повышении устойчивости mTOR с лечением рапамицином.
Количественная оценка интенсивности целевой белковой полосы свидетельствует о том, что mTOR является целевым белком рапамицина. Для того, чтобы получить лучший эффект шаг за шагом, этот эксперимент, возможно, придется повторить несколько раз, чтобы получить подходящий диапазон проназа над соотношением белка.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование расширяет возможности анализа данных в эксперименте DARTS путем мониторинга изменений стабильности белков и оценки аффинности белок-лигандных взаимодействий. В качестве примера для этого анализа используется взаимодействие mTOR-рапамицин.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Фармакология
Теоретическая часть
- DARTS — это метод обнаружения белковых мишеней для малых молекул.
- Он позволяет подтвердить известные взаимодействия белков с малыми молекулами.
- Метод DARTS может быть использован для идентификации потенциальных белковых мишеней природных соединений.
- Взаимодействия белок-лиганд могут быть визуализированы с помощью специфических кривых.
Цель исследования
- Для улучшения анализа данных в экспериментах DARTS.
- Для мониторинга изменений стабильности белков.
- Для оценки аффинности белок-лигандных взаимодействий.
Используемые методы
- Мониторинг изменений стабильности белка.
- Оценка аффинности взаимодействий белок-лиганд.
- Построение кривых протеолитических взаимодействий и кривых дозозависимости.
- Использование mTOR-рапамицина в качестве примера.
Основные результаты
- Улучшенный анализ стабильности белков методом DARTS.
- Успешная оценка аффинности взаимодействия белок-лиганд.
- Визуализация взаимодействий с помощью специфических кривых.
- Демонстрация метода на примере mTOR-рапамицина.
Выводы
- В данном исследовании усовершенствована методика DARTS для проведения более качественного анализа.
- Стабильность белков и аффинность их взаимодействий могут быть эффективно отслеживаемы.
- Полученные результаты могут помочь в идентификации новых белковых мишеней.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Улучшенный метод DARTS представляет собой безмаркерный подход к анализу белков в нативном состоянии для подтверждения связывания малых молекул с мишенью, что способствует снижению рисков на ранних этапах подбора мишени. Позволяя количественно определить аффинность связывания с помощью протеолитических и дозозависимых кривых, этот метод обеспечивает механистическую уверенность при переходе от поиска хитов к оптимизации соединений-лидеров. Данный метод помогает приоритизировать соединения с подтвержденным взаимодействием с мишенью, сокращая количество отсевов из-за ложноположительных результатов при последующем скрининге.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: подтверждает прямое взаимодействие малых молекул, таких как рапамицин, с mTOR в нативных лизатах.
- Практическая ценность: позволяет использовать немодифицированные соединения, избегая артефактов, связанных с метками или тегами, которые могут изменить связывание.
- Прогностическая ценность: позволяет оценивать аффинность для отбора хитов на основе времени пребывания на мишени и сдвигов стабильности.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Позволяет строить количественные кривые протеолиза и кривые «доза-эффект» для подтверждения хитов.
- Воспроизводимость: Стандартизированный рабочий процесс с определенными точками титрования проназы и гашения ингибитором.
- Масштабируемость: Совместимость с многолуночными форматами для тестирования библиотек соединений против очищенных или клеточных мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Подтвержденное взаимодействие с мишенью в клеточных лизатах позволяет экстраполировать результаты на целостные системы.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет отличить специфическое связывание от неспецифического ингибирования протеолиза посредством дозозависимой стабилизации.
- Соответствие доклиническим данным: Подтвержденное взаимодействие mTOR-рапамицин служит эталоном для оценки соединений, нацеленных на данный сигнальный путь.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ проводится в промежутке между подтверждением первичных хитов и оптимизацией ведущих соединений, обеспечивая биофизическую валидацию перед проведением клеточных функциональных тестов.
- Биология открытий: Проверка гипотезы о мишени путем измерения сдвигов стабильности нативных пулов белков, индуцированных лигандом.
- Скрининг: Подтверждение связывания мишени с хитами, полученными в результате биохимического или фенотипического скрининга, с использованием эндогенного белка.
- Аналитика: Оценка аффинности на основе кривых дозозависимости и определение изменений стабильности по протеолитическим профилям.
- Трансляционные исследования: Использование клеточных лизатов для сохранения нативных белковых комплексов и посттрансляционных модификаций.
- Корпоративное повторное использование: Платформа, адаптируемая к различным мишеням и лигандам без необходимости переработки реагентов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прямое измерение стабилизации мишени позволяет объективно оценить эффективность лиганда.
- Практическая ценность: Простой рабочий процесс с использованием стандартного оборудования для лизиса, переваривания протеазами и вестерн-блоттинга.
- Стратегическая ценность: Снижает вероятность ошибочного продвижения кандидатов за счет подтверждения связывания с мишенью на ранних этапах каскада поиска.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе количественных показателей взаимодействия с мишенью.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с вестерн-блоттингом и количественным анализом полос.
- Метод зависит от доступности проназы и коктейлей ингибиторов протеаз для контролируемого переваривания.
- Необходима стандартизация между лабораториями для обеспечения согласованности соотношений проназы к белку и времени инкубации.
- Адаптация метода для мембранных или сложных мишеней может потребовать оптимизации условий лизиса.
- Практическое ограничение: полуколичественный характер анализа требует проведения повторных опытов для надежной оценки аффинности.
