Надежное проектирование и управление стабильными оптогенетическими генными цепями в клетках млекопитающих

Стандартизированный оптогенетический протокол предназначен для лабораторий, заинтересованных в использовании света в качестве стимула для управления клеточными свойствами в инженерных клеточных системах млекопитающих. Этот протокол легко реализовать в лабораториях, незнакомых с оптогенетикой, и предоставляет методы точного пространственного временного управления инженерными биологическими системами. Этот метод имеет широкий спектр применения в конкретных областях исследований, где пространственно-временная информация может быть важна, включая биологию рака, системную биологию и дифференцировку тканей.

Для начала выберите генетические компоненты для объединения связывания в одну генную цепь или плазмиду. Например, сайты интеграции ДНК млекопитающих, светочувствительные элементы или функциональные гены. После сборки и изучения всех необходимых функций, таких как стартовые кодоны, регуляторные или переведенные последовательности, используйте любое программное обеспечение для генной инженерии и молекулярного клонирования, аннотируйте и храните последовательности ДНК для последующего использования и в качестве ссылки.

Проверяйте праймеры вычислительно для построения плазмид с помощью встроенных функций программного обеспечения молекулярного клонирования, например, выравнивания последовательностей. Чтобы генерировать стабильную клеточную линию, трансфектируйте проектные генные цепи и желаемые клетки, используя липосомную смесь ДНК генной цепи с соответствующей рекомбиназой. После того, как клетки станут сливающимися на 80-100%, заморозьте клетки в смеси 45% старой среды, 45% свежей среды и 10% DMSO.

Перенесите оставшиеся клетки в стерильную трубку и выполните одноклеточную сортировку для выделения моноклональных клеток в 96-луночную пластину. Примерно через две-три недели после моноклональной сортировки скважины в пределах 96-луночной плиты должны иметь очаги. Когда достигается слияние от 50 до 60%, разделите ячейки на 12-луночную пластину.

Добавьте прошивку в собранную схему LPA с помощью программы микроконтроллера. Затем объедините 3D-печатные детали в собранной печатной плате с помощью монтажной пластины, печатной платы, светодиодной прокладки, адаптера пластины, 24-луночной пластины, крышки пластины, крепежных болтов, гаек крыла и компонентов штабелирования. Чтобы начать оптогенетический эксперимент, используйте программное обеспечение Iris, доступное на веб-сайте Tabor Lab, чтобы запрограммировать SD-карту для LPA и изучить соответствующие условия освещения.

Затем введите значения интенсивности с техническими репликами для желаемого экспериментального контура. Добавьте около 75 000 клеток на лунку в 24-луночную черную пластину общим объемом 500 микролитров, затем поместите клетки в увлажненный инкубатор с 5% углекислым газом, чтобы они осели в течение двух-шести часов. После переноса клеток в вытяжку культуры тканей в конце инкубации снимите пластиковую крышку и добавьте полоску клейкой фольги в верхнюю часть пластины для минимизации передачи света между лунками, чтобы свет мог проникать только через светодиод, расположенный в нижней части колодца.

Поместите пластину в установленные 3D-части LPA, затем накройте пластину 3D-печатной крышкой LPA, которая прилегает к винтам устройства на каждом углу. Подключите устройство к источнику питания и нажмите кнопку сброса на устройстве LPA, чтобы убедиться, что обновленные настройки эксперимента LPA применены и инкубируют клетки. После инкубации внутри вытяжки для культивирования тканей снимите полоску фольги с пластины и дайте пластине постоять в течение одной-двух минут, чтобы предотвратить образование конденсата на пластиковой крышке.

Затем положите оригинальную пластиковую крышку обратно на пластину и визуализируйте клетки с помощью соответствующего фазового контраста или флуоресцентного микроскопа. Через 24-72 часа после индукции, с последующей трипсинизацией, перенесут все содержимое каждой лунки примерно на 500 микролитров в меченые трубки, оснащенные клеточным сетчатым фильтром. Затем, используя соответствующее программное обеспечение прибора для проточной цитометрии, создайте прямой и боковой затвор рассеяния для захвата отдельных клеток соответствующего размера и зернистости, чтобы исключить мусор и клеточные сгустки.

Как только затвор установлен, захватите приблизительно 10 000 ячеек с соответствующим затвором и отрегулируйте номер ячейки в зависимости от количества требуемых сотовых данных и повторите захват экспериментальных клеток в каждой трубке. После индукции и трипсинизации перенесите все содержимое каждой лунки около 500 микролитров в меченые пробирки. Центрифугируйте клетки в течение пяти минут в 400 раз больше G. После выброса супернатанта переместите образцы в химический дымовой капюшон.

Повторное суспендирование клеток в 750-1000 микролитров 4% PFA, разбавленных в PBS и пипетке вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать сгустки клеток. После 15 минут инкубации добавьте от 750 до 1000 микролитров PBS и снова несколько раз пипетку вверх и вниз, затем гранулируйте клетки в течение пяти минут при 400 раз G при комнатной температуре. После выброса супернатанта переместите образцы в химический вытяжной капюшон и повторно суспендируйте клетки в 750-1000 микролитрах ледяного холодного метанола, как показано на рисунке, и позвольте клеткам сидеть в течение 30 минут в морозильной камере с температурой минус 20 градусов по Цельсию.

После инкубации добавьте от 750 до 1000 микролитров PBS, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Затем, после центрифугирования клеток в течение пяти минут при 400 G, выбросьте супернатант и переместите образцы в химический дымовой капюшон. Повторно суспендируют клетки в 100 микролитрах или другом подходящем разведении меченого первичного антитела и пипетки вверх и вниз шесть-восемь раз, затем инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре.

Затем добавляют от 750 до 1000 микролитров инкубационного буфера и раствора пипетки вверх и вниз несколько раз, затем центрифугируют клетки в течение пяти минут в 400 раз G. Далее повторно суспендируют клетки в 500 микролитрах PBS и разбивают сгустки, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Перенесите все содержимое каждой трубки в меченые трубки с клеточными сетчатыми фильтрами. Подведите клетки к соответствующим приборам проточной цитометрии с помощью лазеров правильных длин волн.

Для приборов была выполнена оптическая калибровка. С помощью полученного изображения рассчитывались значения компенсации для светодиода, вычитался фоновый сигнал и выводилась интенсивность пикселей. Коэффициент вариации был минимальным между 96 скважинами.

Программное обеспечение для калибровки продемонстрировало изменение светодиодов в зависимости от местоположения и создало регулировку шкалы серого, чтобы каждый светодиод был нормализован с одинаковой интенсивностью. Экспрессия генов была индуцирована в инженерных более легких клетках с помощью флуоресцентной микроскопии при различной длительности светового импульса на LPA, и клетки были визуализированы для экспрессии Brightfield и GFP. Используя проточную цитометрию, клетки были индуцированы при разных значениях длины импульса и показали дозовый ответ экспрессии генов, количественно выраженный на уровне популяции более чем четырехкратного изменения от неиндуцированных состояний.

Отрицательная обратная связь достигалась более чем пятикратного снижения шума экспрессии генов, как показано путем сравнения различных значений интенсивности света для более легкой системы с яркой или включенной. Анализ qPCR показал, что сконструированные более легкие клетки экспрессировали уровни РНК в дозочувствительной манере с более чем десятикратной индукцией из неиндукционных состояний, что соответствовало количественной оценке проточной цитометрии. Спроектированная более легкая генная схема показала увеличение количества синего света, что привело к повышению уровня белка KRAS и уровня фосфорилированного ERK.

Может быть выполнено несколько функциональных анализов, включая анализы роста, подвижности клеток, заживления ран, пролиферации или инвазии. Эти методы могут дать конкретное представление о механизмах биологии рака, дифференцировки тканей или лекарственной устойчивости.