Пространственно-временной контроль активности белка через оптогенетическую аллостерическую регуляцию
4 октября 2024 г.
Этот протокол описывает применение сконструированного домена аллостерического переключателя (LightR), активируемого синим светом, для обратимого пространственно-временного контроля активности белка. Используя тирозинкиназу Src в качестве модели, это исследование предлагает тщательно разработанный протокол для разработки и определения характеристик светорегулируемой Src (LightR-Src). Это демонстрирует универсальность этого подхода для всех классов ферментов.
Наши исследования в целом сосредоточены на разработке оптогенетических методов, которые обеспечивают точный пространственно-временной контроль активности белка с помощью света. Мы разрабатываем регулируемые светом домены, называемые lightR, для аллостерической регуляции, что позволяет нам изучать, как пространственно-временная активность белка влияет на клеточную сигнализацию и функции, помогая в доклиническом моделировании заболеваний и разработке терапии. Оптогенетика сталкивается с рядом проблем, включая достижение точного и обратимого контроля активности белка-мишени и точную имитацию эндогенной сигнальной кинетики.
Ключевыми проблемами являются предотвращение нежелательной активации, обеспечение целенаправленной субклеточной активации и управление фототоксичностью для сохранения жизнеспособности клеток. Кроме того, разработка универсально совместимых и надежных инструментов имеет решающее значение для повышения универсальности и воспроизводимости в приложениях. Наш протокол для разработки инструментов lightR уникальным образом сочетает в себе множество передовых функций в одной системе, включая аллостерическую регуляцию, высокую чувствительность, пространственное разрешение, жесткий временной контроль и точную специфичность сигнализации.
Эта интеграция обеспечивает настраиваемость для различных белков-мишеней, устраняя пробелы в других методах, которым может не хватать одной или нескольких из этих критически важных возможностей. Мы заинтересованы в определении ключевых сигнальных и структурных процессов, регулирующих миграцию клеток. Мы стремимся использовать нашу оптогенетическую технологию для анализа регуляции миграции эндотелиальных клеток и взаимодействий.
Понять, как ремоделирование внеклеточного матрикса опосредуется эндотелиальными клетками, и определить, как нарушение регуляции этих процессов способствует развитию заболевания. Для биохимического анализа lightR-киназ накладку один раз по 10 в степени шести клеток lin XE на 3,5 сантиметровую чашку для клеточной культуры для каждой опытной группы, инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение 16-18 часов. На следующий день трансфектируйте клетки выбранной конструкцией ДНК с использованием соответствующего реагента для трансфекции.
Накройте тарелку алюминиевой фольгой и верните ее в инкубатор. После 16-18 часов трансфекции поместите 465-нанометровую светодиодную панельную лампу внутрь инкубатора для тканевых культур. Расположите перфорированную панель из плексигласа на высоте 10 сантиметров над лампой, чтобы добиться освещенности в три милливатта на квадратный сантиметр.
Используйте непрерывное освещение в элементах, экспрессирующих LightR-Src и D388 R-LightR-Src. Включайте и выключайте светодиодную панель вручную для управления подсветкой. По окончании экспериментальных временных точек соберите клетки под безопасным красным светом, аспирируйте среду и промойте клетки холодным PBS.
Глобальное освещение клеток lin XE сконструированным LightR-Src в течение 60 минут показывает фосфорилирование субстратов Src, эндогенного паксиллина и клеток p130Cas, экспрессирующих каталитический неактивный мутант D388 RLightR-Src, не проявляет фосфорилирования субстратов Src при глобальном освещении. Для начала нанесите в пласт два раза по 10 в степени пяти хела-клеток на 35-миллиметровую чашку для культуры тканей в среде для клеточных культур. Инкубируйте клетки в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.
После того, как клетки прикрепятся и достигнут конфлюенции от 60 до 70%, сотрансфектируйте клетки hella с данной смесью. Накройте тарелку алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить случайное освещение ячеек. Затем инкубируйте клетки в течение 16-18 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Далее поместите закрытые стаканы диаметром 25 миллиметров и толщиной 0,17 миллиметра в камеру с шестью лунками. Покройте три круглые стеклянные крышки пятью миллиграммами на литр фибронектина в PBS и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Затем промойте чехол PBS через 16-18 часов после трансфекции.
Соберите трансфицированные клетки хела в безопасном красном свете, затем сыграйте примерно один раз по 10 в степени пяти трансфицированных хела на каждую крышку под безопасным красным светом. Накройте планшет алюминиевой фольгой и инкубируйте в среде для клеточных культур в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Далее подогрейте подготовленный носитель изображения и минеральное масло до 37 градусов Цельсия.
Затем промойте крышки, содержащие клетки, PBS два раза. После окрашивания и промывки клеток осторожно поместите крышку в камеру для визуализации живых клеток. Добавьте в камеру один миллилитр среды для визуализации L15.
Добавьте в среду один миллилитр предварительно подогретого минерального масла, чтобы предотвратить испарение во время визуализации. Держите камеру защищенной от света при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока она не будет готова к съемке. Поместите камеру на предметный столик микроскопа, нагретый до 37 градусов Цельсия.
Выберите одну ячейку, выражающую как быструю вишню LightR-Src, так и Src IRFP. Выберите определенные области интереса в ячейке для освещения. Для этого исследования выберите небольшую область на периферии выбранной клетки.
Визуализируйте выбранную ячейку каждую минуту в течение 20 минут в базальном состоянии до освещения. Продолжайте визуализацию в течение 50 минут, освещая локально, а затем через 20 минут после активации в общей сложности 90 минут. После создания образа, сохраните фильмы в формате файла tif stack для анализа.
Глобальное освещение hela-клеток привело к локализации быстрого LightR-Src в фокальных спайках, которые были обращены вспять после выключения синего света. Это освещение также вызвало значительное увеличение распространения клеток, которое прекратилось, как только синий свет был выключен. Каталитический неактивный мутант D388 R-LightR-Src не показал распространения клеток.
Локализованное освещение hela-клеток, экспрессирующих быстрый LightR-Src, приводило к накоплению конструкции в очаговых спайках, что приводило к локализованным выпячиванию мембран с 50-минутным освещением. В течение 20 минут темноты после освещения не наблюдалось дальнейшего увеличения площади. Fast LightR-Src постепенно исчезал из фокальных спаек в темной фазе.
Центроид клетки сместился в сторону освещенной области. После быстрой активации LightR-Src, указывающей на направленное движение клеток.
Обзор
Данное исследование посвящено разработке сконструированного аллостерического переключателя, активируемого синим светом (LightR), для точного пространственно-временного контроля активности белков на примере тирозинкиназы Src. Данный протокол позволяет исследователям осуществлять обратимый, регулируемый светом контроль над функциями белков, что способствует более глубокому пониманию динамики клеточной сигнализации.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Оптогенетика
- Белковая инженерия
- Клеточная сигнализация и миграция
Теоретические основы
- Проблемы оптогенетики включают достижение точного контроля активности белков и имитацию эндогенной передачи сигналов.
- Устранение фототоксичности и нежелательной активации имеет решающее значение для сохранения жизнеспособности клеток.
- В исследовании представлен новый инструмент LightR, сочетающий в себе высокую чувствительность, пространственное разрешение и возможности специфической передачи сигналов.
Используемые методы
- Инженерия и характеристика домена LightR для киназы Src
- Использование клеток HeLa и lin XE в экспериментах
- Биохимические анализы и методы визуализации живых клеток
Основные результаты
- LightR-Src обеспечивает контролируемое фосфорилирование субстратов Src при освещении синим светом.
- Локальное освещение индуцирует распластывание клеток и направленное движение клеток HeLa.
- Активация и деактивация LightR-Src демонстрируют обратимость и специфичность в клеточных функциях.
Выводы
- В данном исследовании представлен инновационный метод оптогенетического контроля активности белков, который дает ценную информацию о поведении клеток.
- Полученные результаты имеют важное значение для доклинических моделей в исследованиях заболеваний и разработке терапевтических методов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точный пространственно-временной контроль активности белков является критически важной задачей на этапах раннего поиска и механистического снижения рисков в биофармацевтических исследованиях и разработках.&D. Оптогенетическая система LightR обеспечивает обратимую, регулируемую светом аллостерическую модуляцию целевых белков, что позволяет с высокой степенью достоверности исследовать сигнальные пути и клеточное поведение. Эта возможность повышает прогностическую точность и трансляционную преемственность на всех этапах: от первоначального открытия до разработки доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях&D
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую проверять терапевтические гипотезы путем временного контроля функций белков в живых клетках.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет изоляции эффектов активации или инактивации конкретных белков.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней благодаря обратимой модуляции (включение/выключение) и минимальной фоновой активности.
- Повышает прогностическую достоверность при анализе путей и определении приоритетности мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает использование валидированных светочувствительных биологических систем для количественного анализа в клеточных тестах.
- Позволяет проводить воспроизводимый и масштабируемый скрининг соединений, влияющих на активность белков, регулируемую светом.
- Способствует стандартизации анализа за счет минимизации фоновой активности и обеспечения строгого временного контроля.
- Позволяет повторно использовать платформу для различных классов ферментов и целевых белков.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, имеющим значение при патологиях, обеспечивая субклеточный и тканевый контроль сигнальных событий.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет моделирования динамических клеточных ответов.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков благодаря надежной обратимой модуляции путей развития болезни.
- Позволяет проводить механистические исследования миграции клеток и ремоделирования внеклеточного матрикса, имеющие значение для прогрессирования заболевания.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Оптогенетическая система LightR интегрируется в континуум от фундаментальных открытий до доклинических исследований, обеспечивая возможность модуляции активности белков на основе выдвинутых гипотез и количественный анализ последующих эффектов.
- Открытийная биология: Обеспечивает проверку нулевой гипотезы и уточнение сигнальных путей путем изоляции функции белка с помощью света.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для оценки соединений в анализах с световым регулированием.
- Аналитика: Предоставляет данные о фосфорилировании и миграции клеток для сравнительного анализа при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает этап открытий с доклиническими моделями, обеспечивая обратимый контроль белков, имеющих значение для патогенеза заболеваний.
- Корпоративное использование: Предлагает модульную, адаптируемую платформу для различных классов мишеней и изучения механизмов действия.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость оптогенетических анализов.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), а также эффективность использования капитала за счет обеспечения надежных функциональных исследований.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению валидированных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области молекулярного клонирования, оптогенетики и визуализации живых клеток.
- Необходим доступ к системам освещения синим светом и платформам для количественной визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация для обеспечения воспроизводимости подачи света и анализа данных.
- Метод адаптируем к различным типам клеток и классам ферментов при соответствующем дизайне конструктов.
- Для сохранения жизнеспособности клеток и целостности данных необходимо контролировать фототоксичность и побочные эффекты.
