Наблюдение за функцией островков и взаимодействием островковых и иммунных клеток в живых срезах ткани поджелудочной железы
12 апреля 2021 г.
В этом исследовании представлено применение живых срезов ткани поджелудочной железы для изучения физиологии островков и взаимодействия островковых и иммунных клеток.
Наш протокол поможет ответить на влияние, которое иммунные клеточные взаимодействия оказывают на функциональность островков. Метод среза живой ткани поджелудочной железы позволяет изучать физиологию и функцию островков при сохранении тканей, лежащих в основе патологий, и нативной микросреды. Этот метод может дать представление о болезненных процессах заболеваний поджелудочной железы, таких как панкреатит, диабет I типа и диабет II типа.
Для начала расположите блоки на держателе образца таким образом, чтобы они не превышали ширину лезвия, гарантируя, что лезвие может двигаться вперед на минимально возможное расстояние, когда вибратом движется медленно. Нанесите линию суперклея на держатель образца, сделав тонкий слой с помощью конца дозатора клея, затем переверните блоки тканей на клей так, чтобы сторона, близкая к ткани, была обращена вверх. Аккуратно надавите на блоки и дайте клею высохнуть в течение трех минут.
Затем прикрепите пластину к вибратому с помощью винта и отрегулируйте высоту и расстояние, которое перемещается так, чтобы лезвие двигалось по длине блоков и чуть выше них. Осторожно подталкивайте блоки щипцами, чтобы убедиться, что клей высох, а затем заполните лоток вибратома охлажденным внеклеточным раствором, пока лезвие не будет покрыто. Установите вибратом, чтобы сделать срезы толщиной 120 микрометров и запустите его, затем наблюдайте за срезами, отрывающимися от тканевых блоков.
Поднимите ломтики, когда они выплывают из блока, поместив под них кисть или щипцы, и поместите ломтики в бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, содержащий три миллимоляра D-глюкозы и ингибитор трипсина. Поместите пластины, содержащие ломтики, на коромысл и инкубируйте при комнатной температуре в течение часа при 25 оборотах в минуту. Если ломтики нужно хранить дольше, поместите ломтики в 15 миллилитров ломтик-культуральной среды и поместите пластину в инкубатор.
Инкубируйте подготовленные ломтики при 37 градусах Цельсия для исследований в тот же день или перенесите ломтики, которые культивируются при 24 градусах Цельсия в течение ночи, до 37 градусов Цельсия в течение по крайней мере одного часа до эксперимента. Включите микроскоп по крайней мере за час до записи и уравновесьте верхнюю часть инкубатора до 37 градусов Цельсия. Закрепите на сцене стеклянную нижнюю чашку Петри, содержащую ломтик.
Сфокусируйте микроскоп, установив объектив 10X в режиме яркого поля, и найдите островки в режиме яркого поля, выполнив поиск оранжево-коричневых овалов внутри среза. Переключите микроскоп на конфокальную визуализацию, нажав кнопку CS на контроллере сенсорного экрана микроскопа. Для просмотра островков с использованием отражательной способности включите лазерный детектор 638 и детектор PMT.
Установите мощность лазера от одного до 2% и выключите выемчатые фильтры. Используйте 405-нанометровый лазер и детектор PMT для наблюдения за окрашиванием нуклеиновых кислот. Гибридный детектор для обнаружения антител CD8 и 488-нанометровый лазерный и гибридный детектор для просмотра тетрамера инсулина.
Центрируйте интересующий островок в поле зрения с помощью ручек X и Y контроллера сцены. Как только интересующий островок будет найден, переключитесь на цель 20X и увеличьте масштаб, чтобы островок занимал большую часть кадра. Возьмите z-стек островка, затем найдите лучшие оптические участки, где клетки живы и любые окружающие иммунные клетки находятся в фокусе.
Установите микроскоп для записи в режиме XYZT и оптимизируйте настройки для записи z-стека выбранных шагов каждые 20 минут в течение нескольких часов. Островки в срезе ткани поджелудочной железы были визуализированы с использованием микроскопии яркого поля и отраженного света. Инсулин в островках увеличивает зернистость и вызывает поглощение большого количества отраженного света, увеличивая видимость островков.
Жизнеспособность живого среза ткани поджелудочной железы человека оценивали путем окрашивания. Живые клетки обозначены зеленым цветом, а мертвые клетки — синим. Еще одним положительным показателем жизнеспособности является наблюдаемая базальная активность.
Когда живой срез поджелудочной железы был загружен клеточным проницаемым индикатором кальция, стимуляция глюкозой наблюдалась как в мышиных, так и в человеческих срезах поджелудочной железы. Флуоресценция отдельных клеток во время стимуляции глюкозой также была количественно определена. Интактные и больные островки наблюдались с помощью окрашивания дитизоном и микроскопии отраженного света.
Больные островки начинают терять зернистость из-за инфильтрации иммунных клеток и гибели клеток. Популяции иммунных клеток могут быть идентифицированы с помощью антител CD8 и окрашивания тетрамера инсулина. Совместное окрашивание указывает на то, что клетки являются эффекторными Т-клетками, которые специфически нацелены на антиген инсулина.
Самое важное, что нужно помнить в этой процедуре, это постоянно держать срезы в растворах ингибитора протеазы. После этой процедуры могут быть выполнены многочисленные функциональные возможности в экспериментах с иммунными клетками, позволяющие изучить влияние взаимодействия иммунных клеток и функцию островков.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод применения живых срезов ткани поджелудочной железы для изучения физиологии островков и взаимодействий между островками и иммунными клетками. Этот метод позволяет исследовать функциональность островков с сохранением естественной микросреды.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунология
Теоретическая часть
- Клетки островков играют ключевую роль в метаболизме глюкозы.
- Взаимодействия иммунных клеток могут влиять на функцию островков.
- Понимание этих взаимодействий жизненно важно для лечения заболеваний поджелудочной железы.
- Живые срезы тканей позволяют сохранить физиологический контекст клеток.
Цель исследования
- Изучить влияние взаимодействий иммунных клеток на функциональность островков.
- Получить представление о заболеваниях поджелудочной железы, таких как сахарный диабет I и II типа.
- Разработать метод, позволяющий сохранить патологии тканей и микроокружение.
Используемые методы
- Подготовка живых срезов тканей поджелудочной железы.
- Использование вибратома для прецизионного срезания.
- Применение суперклея для стабилизации блока ткани.
- Наблюдение за взаимодействием островковых и иммунных клеток в режиме реального времени.
Основные результаты
- Метод получения живых срезов тканей поджелудочной железы эффективно сохраняет физиологию островков.
- Было показано, что взаимодействия иммунных клеток существенно влияют на функцию островков.
- Данный подход позволяет изучать лежащие в основе патологии.
- Полученные данные могут быть использованы для разработки стратегий лечения заболеваний поджелудочной железы.
Выводы
- Живые срезы тканей поджелудочной железы являются ценным инструментом для изучения физиологии островков.
- Данный метод позволяет углубить понимание иммунных взаимодействий при функционировании островков.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для поиска способов лечения заболеваний поджелудочной железы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Живые срезы тканей поджелудочной железы позволяют напрямую наблюдать взаимодействия между островковыми и иммунными клетками в сохранной нативной микросреде, представляя собой физиологически релевантную систему для механического снижения рисков при валидации мишеней для терапии диабета. Данный подход повышает прогностическую достоверность за счет поддержания жизнеспособности тканей и сохранения патологических изменений, характерных для сахарного диабета 1-го и 2-го типов, что позволяет научно-исследовательским группам оценивать терапевтические гипотезы в контексте соответствующего заболевания. Этот метод связывает фундаментальную биологию и трансляционные исследования, обеспечивая количественные показатели функции островков и динамики иммунных клеток в режиме реального времени, что имеет решающее значение для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на ранних этапах поиска препаратов для лечения диабета.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации инфильтрации иммунными клетками и ее прямого влияния на целостность гранул островков и высвобождение инсулина.
- Операционная ценность: сохраняет нативную архитектуру ткани и межклеточные взаимодействия, уменьшая механистическую неоднозначность при валидации мишеней для иммуномодулирующей терапии диабета.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов путем установления связи между активностью иммунных клеток и функциональным упадком островков, обеспечивая считываемый результат вовлечения мишени, согласованный с биомаркерами.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных показателей флуоресценции индикаторов кальция и окрашивания тетрамеров инсулина для оценки дозозависимого воздействия соединений на функцию островков.
- Практическая ценность: стандартизирует протоколы подготовки тканей и визуализации, обеспечивая воспроизводимость базовых измерений в различных экспериментальных сериях и модельных системах.
- Масштабируемость: совместимость с микроскопией в режиме таймлапс и получением Z-стеков, что позволяет проводить лонгитюдный мониторинг динамики иммунных клеток на протяжении нескольких часов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Сохраняет основные патологические изменения тканей поджелудочной железы человека и мыши, что позволяет изучать механизмы сахарного диабета 1-го и 2-го типов в релевантной модели заболевания.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты ранних открытий с доклинической валидацией за счет сохранения межклеточных взаимодействий, критически важных для иммуноопосредованной дисфункции островков.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет визуализировать взаимодействия эффекторных Т-клеток с антигенами инсулина с помощью двойного окрашивания на CD8 и тетрамер инсулина, что помогает принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований (go/no-go).
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод срезов живой ткани поджелудочной железы вписывается в континуум открытий — от валидации мишени до доклинических исследований, предоставляя релевантную заболеванию систему, которая сохраняет жизнеспособность тканей и микроокружение для изучения механизмов взаимодействий между островками и иммунной системой.
- Поисковая биология: поддерживает проверку гипотез, обеспечивая наблюдение в реальном времени за воздействием иммунных клеток на физиологию островков, что позволяет прояснить пути, участвующие в патогенезе диабета.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу срезы тканей с количественными показателями потока кальция, стимулированного глюкозой, и связывания тетрамера инсулина, что способствует надежной оценке соединений.
- Аналитика: генерирует данные таймлапс-съемки XYZT и оптические срезы z-стека, позволяя группам исследователей количественно определять клеточные ответы и локализацию иммунных клеток с течением времени.
- Трансляционные исследования: сохраняют патологии, имеющие значение для заболевания, и естественную микросреду, обеспечивая непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации иммуномодулирующих механизмов.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для изучения функции островков в различных моделях заболеваний и терапевтических модальностях, сокращая необходимость в избыточной разработке моделей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени, снижая механистическую неоднозначность за счет прямой визуализации взаимодействий между островками и иммунными клетками в интактной ткани.
- Практическая ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость благодаря контролируемым протоколам срезания, инкубации и визуализации, которые поддерживают жизнеспособность и функцию срезов.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), связывая активность иммунных клеток с функциональным угасанием островков, что снижает биологические риски на поздних стадиях разработки препаратов для лечения диабета.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию иммуномодулирующих кандидатов с поправкой на риск, основываясь на их способности смягчать иммуноопосредованную дисфункцию островков в релевантной для заболевания системе.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с тканями, нарезки на вибратоме и конфокальной микроскопии для прижизненной визуализации динамики иммунных клеток.
- Зависит от наличия оборудования, включая вибратом, конфокальный микроскоп с лазерными детекторами (405nm, 488nm, 638nm) и предметный инкубатор для контроля условий окружающей среды.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами процессов подготовки срезов, состава буфера (бикарбонатный раствор Кребса-Рингера с D-глюкозой и ингибитором трипсина) и условий инкубации для обеспечения воспроизводимости результатов.
- При применении метода к различным модельным системам (человек против мыши) или патологическим состояниям (СД1 против СД2) требуются соответствующие адаптации для поддержания жизнеспособности тканей и патологической релевантности.
- Включает такие практические ограничения, как необходимость использования ингибиторов протеаз для сохранения целостности срезов и технические сложности поддержания оптической прозрачности при длительной таймлапс-съемке.
