Рабочий процесс "Cell Surface Capture" для количественного определения протеома клеточной поверхности без меток

Этот протокол позволяет нам исследовать антигены, присутствующие на поверхности различных типов клеток, чтобы найти антигены, специфичные для этого типа клеток или тканей. Метод, который мы представляем здесь, позволяет обогащать белки клеточных мембран из лизата целой клетки, в конечном итоге для анализа с помощью протеомики, основанной на масс-спектрометрии. Таким образом, одним из конкретных применений этого протокола является его применение к опухолевым клеткам для поиска антигенов, присутствующих на поверхности этих раковых клеток, а не нормальных клеток, которые могли бы служить новыми мишенями для иммунотерапии рака.

Следует отметить, что в отношении этого протокола может быть важно оптимизировать ввод образца для интересующего вас эксперимента. Таким образом, для поиска оптимальных условий может потребоваться несколько итераций или титрований. Так что демонстрировать процедуру будет Акул Наик, младший специалист из нашей лаборатории.

Для начала снимите замороженную клеточную гранулу, меченную биотином, с температуры минус 80 градусов Цельсия и разморозьте ее на льду. Добавьте в гранулу 500 микролитров 2X Lysis Buffer, тщательно перемешайте и энергично перемешайте в течение 30 секунд. Обработайте лизат клеток ультразвуком на льду и центрифугируйте лизат при 17 200 G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы удалить оставшийся мусор.

Пока лизат центрифугируется, добавьте 100 микролитров гранул агарозной смолы NeutrAvidin в фильтрационную колонку, прикрепленную к вакуумному коллектору. Примените легкий пылесос и промойте шарики, налив на них 3 миллилитра буфера для стирки 1. Снимите фильтрационную колонну с вакуумного коллектора, закройте дно крышкой и добавьте в колонку с шариками осветленный клеточный лизат.

Закройте верхнюю часть колонны крышкой и инкубируйте лизат с шариками на роторе «встык» в течение 120 минут при температуре 4 градуса Цельсия. После завершения инкубации лизата поместите фильтрационную колонну обратно на вакуумный коллектор и примените мягкий вакуум. Промойте шарики, налив на них пять миллилитров буфера для стирки 1.

Повторите этап стирки с пятью миллилитрами буфера для стирки 2 и буфера для стирки 3. После того, как последний буфер для промывки полностью пройдет через валики, снимите колонну с коллектора. Затем добавьте 100 микролитров раствора лизиса к шарикам и переложите их в 1,7-миллилитровую микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белков с помощью пипетки.

Коротко закрутите трубку, чтобы осесть шарики и удалите 50 микролитров раствора. Затем поместите трубку на шейкер с нагревательным блоком при температуре 65 градусов Цельсия на 10 минут при 1000 оборотах в минуту, встряхивая. Восстановите суспендию высушенного трипсина в пробирке для переваривания из набора, добавив 210 микролитров раствора ресуспензии и несколько раз пипетируя его вверх и вниз, чтобы убедиться, что весь высушенный трипсин ресуспендирован.

По окончании инкубации бусин выньте ее из шейкера с нагревательным блоком и добавьте в бусины 50 микролитров ресуспендированного раствора трипсина. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 500 об/мин в течение не менее 90 минут, чтобы переварить белок. Как только разложение будет завершено, переложите раствор, содержащий гранулы, в спиновую колонку и вставьте колонку в микроцентрифугу объемом 1,7 миллилитра с низким связыванием белка.

Вращайте трубку, чтобы отделить переваренный пептидный раствор от шариков. Далее добавьте 100 микролитров стоп-раствора, чтобы остановить реакцию пищеварения и подкислить пептидный раствор. С помощью адаптера для пробирки поместите обессоливающую колонку в микроцентрифугу объемом 1,7 миллилитра с низким связыванием белка.

Добавьте в колонку весь раствор подкисленного пептида. Вращайте колонку при 3 800 G в течение 3 минут, чтобы раствор протекал через колонку. Откажитесь от проточного потока, так как пептиды теперь связаны с колонкой.

Добавьте в колонку 200 микролитров раствора Wash 1, отверните при 3 800 г в течение 3 минут при комнатной температуре, а затем выбросьте проточный. Повторите этап промывки с 200 микролитрами раствора Wash 2. Перенесите колонку в новую пробирку для микроцентрифуги объемом 1,7 мл объемом 1,7 миллилитра с низким связыванием белков.

Добавьте в колонку 100 микролитров раствора элюирования и крутите при 3 800 G в течение 3 минут при комнатной температуре. Теперь пептиды вымываются из колонки в пробирку. Поместите пептидный раствор в вакуумную центрифугу и дайте ему высохнуть в течение ночи.

Поместите высушенные пептиды при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к количественному определению и анализу на масс-спектрометре. Протеомный анализ был проведен для характеристики обогащенных белков клеточной поверхности с помощью жидкостной хроматографии, тандемной масс-спектрометрии. Конечная концентрация пептида примерно 630 нанограмм на микролитр была получена на основе колориметрического количественного анализа пептидов.

Данные масс-спектрометрии, проанализированные с помощью MaxQuant, и последующий анализ набора данных белков клеточной поверхности дали 601 поверхностный белок в образце, что составляет примерно 27% от всех идентифицированных белков. Здесь показан график, представляющий распределение идентифицированного белка по шкале Андромеды, а точечная диаграмма иллюстрирует корреляцию между образцами. На ящичковых диаграммах был изображен вариант от одного пробега к другому.

А график распределения по выборкам представлял качество данных репликатов. Самое главное, о чем следует помнить, это о том, где находятся пептиды на каждом этапе. Сначала они находятся в растворе, затем они связываются с гранулами до разложения, затем они связываются с обессоливающей колонной, пока они окончательно не будут элюированы.

После этой процедуры существуют различные способы проверки нескольких идентифицированных белков, такие как таргетная проточная цитометрия и таргетная протеомика. Это даст более подробную информацию об уровнях экспрессии этих белков в образце.