Усовершенствованные модели липофусцина и количественная оценка способности фагоцитоза наружного сегмента в высокополяризованных культурах пигментного эпителия сетчатки человека
14 апреля 2023 г.
В этом протоколе описывается модель накопления липофусцина в высокодифференцированных и поляризованных культурах пигментного эпителия сетчатки человека (RPE) и улучшенный анализ фагоцитоза наружного сегмента (OS) для определения общей способности RPE потреблять/деградировать OS. Эти методы преодолевают ограничения предыдущих моделей липофусцина и классических анализов фагоцитоза наружного сегмента с погоней за пульсом.
В то время как липофусцин повсеместно накапливается в РПЭ с возрастом, определить его токсичность было сложно. Здесь мы разрабатываем протоколы, которые позволяют нам развивать липофусциноподобное накопление в сильно поляризованных и зрелых культурах RPE, чтобы помочь определить влияние липофусцина на физиологию RPE. Изучение токсичности липофусцина у человека осложняется тем фактом, что липофусцин уменьшается по мере того, как РПЭ умирает.
Животные модели токсичности липофусцина имели совершенно разные результаты. Мы тщательно создали in vitro модели накопления липофусциноподобного материала, чтобы облегчить изучение токсичности липофусцина. Ключом к успеху наших моделей является поддержание высокодифференцированных культур при одновременном индуцировании генезиса липофусцина с помощью того же процесса, который запускает липофусцин in vivo, а именно фагоцитоза внешних сегментов фоторецепторов.
Наш протокол in vitro уникален тем, что липофусциноподобный материал накапливается в культурах RPE, которые высокодифференцированы, чтобы точно имитировать RPE in vivo. В этих условиях мы обнаружили, что культура РПЭ обладает высокой устойчивостью к накоплению липофусцина и токсическому действию липофусцина. Кроме того, в процессе анализа фенотипов, индуцированных липофусциноподобным накоплением в наших культурах RPE, мы создали новый тип анализа фагоцитоза, называемый общей потребительской емкостью.
Этот анализ позволяет нам определить всю способность RPE к фагоцитозу внешних сегментов, избегая при этом некоторых смешанных интерпретаций, которые приходят с классическими анализами фагоцитоза с погоней за пульсом. Мы рады использовать эту модель накопления липофусциноподобного материала, чтобы лучше понять, какие стрессоры RPE могут взять обычно инертный липофусцин в более патологическую роль в гибели клеток RPE.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено изучению эффектов накопления липофусцина в высокодифференцированных культурах эпителия ретинального пигмента (РПЭ) человека, что позволяет получить представление о токсичности липофусцина и его связи с физиологией РПЭ. В работе представлены новые протоколы, расширяющие возможности изучения воздействия липофусцина, а также инновационный метод анализа фагоцитоза для оценки общей способности РПЭ к поглощению наружных сегментов.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Клеточная биология
- Физиология сетчатки
- Возрастная дегенерация сетчатки
Теоретические основы
- С возрастом в РПЭ происходит накопление липофусцина, что затрудняет оценку токсичности.
- Модели in vitro воспроизводят накопление веществ, подобных липофусцину, для исследований токсичности.
- Поддержание дифференцированных культур РПЭ имеет решающее значение для точного моделирования.
Используемые методы
- Накопление липофусцин-подобного материала in vitro в культурах зрелого РПЭ.
- Модели эпителиальных клеток пигментного слоя сетчатки человека.
- Анализ общей фагоцитарной способности.
Основные результаты
- Разработаны высокодифференцированные культуры РПЭ, устойчивые к токсичности липофусцина.
- Новый метод анализа позволяет переоценить эффективность фагоцитоза наружных сегментов.
- Определены условия, при которых липофусцин становится патогенным.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует потенциал моделей in vitro для изучения стрессоров РПЭ, связанных с липофусцином.
- Полученные результаты способствуют пониманию механизмов дегенерации сетчатки и определению потенциальных терапевтических мишеней.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное моделирование накопления липофусцина и фагоцитоза в культурах эпителия ретинального пигмента (РПЭ) человека восполняет критический пробел в понимании возрастной дегенерации сетчатки и болезни Штаргардта. Внедрение высокодифференцированных моделей РПЭ и количественных анализов позволяет снизить механистические риски и повысить прогностическую достоверность при поиске терапевтических средств на ранних стадиях. Эти достижения способствуют принятию решений по формированию портфеля препаратов за счет уточнения значимых для заболевания путей и функциональной валидации мишеней в биологии сетчатки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы токсичности липофусцина в физиологически релевантных системах РПЭ человека.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем моделирования путей фагоцитоза и деградации, имеющих значение при патологии.
- Способствует механистическому снижению рисков при разработке потенциальных методов терапии дисфункции РПЭ.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных, высокополяризованных культур РПЭ для воспроизводимого скрининга соединений.
- Вводит количественные анализы «общей потребляющей способности» для надежного измерения эффективности фагоцитоза.
- Обеспечивает стандартизацию и масштабируемость для высококонтентного скрининга модуляторов функции РПЭ.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с конечными точками, имеющими значение для патологии при дегенерации сетчатки человека.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров путем количественной оценки фагоцитарной дисфункции, связанной с накоплением липофусцина.
- Оптимизирует продвижение терапевтических кандидатов, направленных на поддержание здоровья RPE, с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная методология объединяет этапы от раннего поиска до идентификации ведущих соединений, обеспечивая непрерывный цикл механистических исследований и количественного скрининга в моделях заболеваний сетчатки.
- Биология открытий: позволяет проверять гипотезы о токсичности липофусцина и путях стрессового воздействия на РПЭ.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные анализы фагоцитоза для оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет данные спектральной визуализации и вестерн-блоттинга для сравнительного анализа функций РПЭ.
- Трансляционные исследования: связывает механизмы, изученные in vitro, с доклиническими моделями заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для моделирования заболеваний РПЭ и разработки аналитических методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в сетчатке.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов RPE.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает основу для принятия решений о продолжении или прекращении разработок и снижает биологические риски на поздних этапах в портфелях препаратов для сетчатки.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию терапевтических программ, нацеленных на RPE, с учетом рисков.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы с культурами РПЭ человека и протоколами их дифференцировки.
- Необходим доступ к оборудованию для конфокальной микроскопии и инфраструктуре для проведения вестерн-блоттинга.
- Требуется межгрупповая стандартизация методов количественной оценки фагоцитоза и аутофлуоресценции.
- Может потребоваться адаптация метода для различных источников РПЭ или моделей заболеваний.
- Интерпретация токсичности липофусцина зависит от модели и может не в полной мере отражать сложность процессов in vivo.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:42
Preparation of Photo‐Oxidized Outer Segment Tips and Fragments
6:27
Characterization of the Lipofuscin‐Like Granule Spectrum and Composition
8:26
Assessing the Effects of Lipofuscin‐Like Granules on RPE Phagocytosis: Total Consumptive Capacity
