Анализ функций малого ГТФаз по микроинъекции Плазмиды в поляризованных эпителиальных клеток

Данная процедура позволяет оценить влияние малых ГТФаз на поляризованный мембранный транспорт. Сначала проведите ко-инъекцию ДНК-плазмид, кодирующих малую ГТФазу и репортерные белки, в ядра поляризованных клеток. Затем экспрессируйте ДНК при температурах, которые приведут к задержке репортерных белков в эндоплазматическом ретикулуме или в ТГН, в то время как малая ГТФаза будет накапливаться в цитозоле; далее проведите отслеживание перемещения репортерного белка к поверхности клетки в присутствии циклогексимида для предотвращения дальнейшего синтеза белков.

Наконец, проведите мечение репортерного белка на поверхности клетки для иммунофлуоресцентного анализа. Результаты, полученные с помощью этого метода, позволяют визуализировать изменение поверхностной локализации с помощью конфокальной микроскопии. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как трансфекция, является то, что при кратковременной гиперэкспрессии, достигаемой с помощью микроинъекций, вторичные эффекты минимальны, что позволяет изучать первичные эффекты исследуемых белков.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области полярности клеток, например, о том, как малые GTPазы регулируют поляризованный мембранный транспорт. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как отдельные этапы, необходимые для успешной микроинъекции, трудно объяснить без визуальных вспомогательных средств. Выделите свободную от эндотоксинов плазмидную ДНК с помощью набора Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep kit в соответствии с протоколом производителя. Для данного эксперимента используйте три прозрачных 12-миллиметровых фильтра Transwell с размером пор 0,4 мкм для культивирования.

Рассадите клетки MDCK пятого пассажа в количестве 4 × 10⁴ клеток на каждый фильтр. Через два дня изучите культуру под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки растут в виде замкнутого монослоя. Для микроинъекций.

В день микроинъекции подготовьте чашки размером 360 на 15 мм с пятью литрами ростовой среды MM с добавлением 15 мМ HEIS и поместите их в инкубатор при 39 °C. Кроме того, подготовьте три 12-луночные планшеты с одним миллилитром ростовой среды MEM с добавлением 50 мМ HEIS и 0,1 мг/мл циклогексимида и поместите их в инкубатор при 31 °C. Включите микроскоп для микроинъекций, настроенный как инвертированный микроскоп с подогреваемым столиком, объективами 10x и 32x, а также системой FemtoJet.

Установите температуру нагреваемого столика на 39 °C. Также откройте подачу азота из газового баллона к пневматическому столу. Теперь разведите ДНК фильтрованной водой до конечной концентрации 0,2 mg/mL.

Затем центрифугируйте ДНК в микроцентрифуге при 13 000 об/мин в течение 30 минут. Снимите верхнюю фазу и перенесите ее в новую пробирку. Далее подготовьте клетки MDCK: извлеките первый фильтр из чашки для культивирования с помощью хирургического скальпеля, вырежьте фильтр из держателя и поместите его в подготовленную планшетку размером 60×15 мм, содержащую 5 мл подогретой до 39 °C ростовой среды MEM с добавлением 50 мМ HEIS.

Чтобы прижать фильтр в чашке для культивирования, поместите хирургический скальпель в центр фильтра, а затем перенесите чашку на подогреваемый предметный столик микроскопа. Загрузите от двух до трех µL разведенной ДНК в иглу для микроинъекций. Поверните защитный колпачок иглы и снимите его.

Чтобы установить иглу в держатель, нажмите клавишу меню инжектора и убедитесь, что клапан закрыт. Вкрутите иглу в держатель. Будьте осторожны и не затягивайте иглу слишком сильно.

Во избежание поломки снова нажмите клавишу меню. Таким образом, приложенное компенсационное давление предотвратит засасывание среды в иглу во время процедуры микроинъекции. В завершение нажмите на джойстик, чтобы стереть сохраненную позицию возврата и опустить иглу на клетки.

Используйте объектив 10x и поместите иглу в световой пучок над жидкостью. Теперь сфокусируйтесь на клетках. Снова переместите фокус вверх, повернув ручку фокусировки на 180 градусов вверх, и найдите иглу.

Медленно перемещайте иглу, пока она не окажется в фокусе. Затем снова выведите ее из фокуса. Повторите процедуру, чтобы вновь сфокусироваться на клетках.

Снова настройте фокус, опуская иглу. Повторяйте процедуру до тех пор, пока игла не коснется поверхности среды, при этом будет наблюдаться ореол. Продолжайте движение до тех пор, пока клетки не окажутся в фокусе, а игла останется размытой, находясь вне фокальной плоскости.

Теперь переключитесь на объектив 32x и выполните грубую фокусировку. Установите предел по оси Z, коснувшись кончиком иглы апикальной мембраны и отступив примерно 10 micrometers, так как ядра расположены примерно на 10 micrometers ниже апикальной мембраны.

Теперь как можно быстрее выведите иглу на несколько микрон из фокальной плоскости. Наведите иглу над ядром, затем нажмите и отпустите кнопку инъекции на джойстике. Для подбора подходящего давления инъекции начните с 95 PSI.

Если давление слишком высокое, клетки разрываются. Если давление слишком низкое, белая точка сохраняется, но больше ничего не происходит. Выполните успешную инъекцию, сопровождающуюся фазовым переходом без изменения размера клетки.

Введите от 100 до 500 клеток в отверстие скальпеля, расположенного над клетками. Затем поместите клетки вместе с чашкой для культивирования и скальпелем в инкубатор при температуре 39 °C и инкубируйте в течение двух часов. В завершение перенесите клетки в подготовленный 12-луночный планшет, содержащий 1 мл среды MEM с добавлением 50 мМ и 0,1 мг/мл циклогексимида, и инкубируйте в течение двух часов при температуре 31 °C.

Чтобы избежать выгорания экспрессированного сигнала GFP, защищайте образцы от света, накрывая их алюминиевой фольгой во время всех последующих процедур окрашивания поверхности. Поместите чашку с культурой клеток на металлическую пластину со льдом и промойте. Один раз ледяным раствором PBS++, поместите чистый кусочек парафильма на металлическую пластину со льдом и нанесите пипеткой капли антитела объемом 30 µL, распознающего эктодомен интересующего белка.

Теперь поместите фильтр с клетками перевернутым способом на каплю и нанесите несколько капель антитела на обратную сторону фильтра. Инкубируйте в течение одного часа на льду. Промойте клетки трижды ледяным PBS++ и зафиксируйте 3% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем промойте клетки один раз раствором PBS++ и выдержите в PBS++ в течение пяти минут. Теперь инкубируйте клетки в блокирующем проницаемом буфере. Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, разведите первичные антитела 1:200 в BPB для детектирования экспрессируемого RAB GTP ACE, центрифугируйте в течение 10 минут при 13 000 об/мин; нанесите пипеткой 30 µL раствора антител на чистый парафиновый срез, помещенный во влажную камеру.

Поместите фильтры с клетками нижней стороной на капли антител и инкубируйте в течение одного часа. После этого при комнатной температуре перенесите фильтры с клетками обратно в 12-луночный планшет правильной стороной вверх и в течение 30 минут проведите пять промывок раствором BPB при комнатной температуре, затем проведите инкубацию с соответствующими вторичными антителами, завершив её этапом промывки.

Трижды погрузите фильтр с клетками в деионизированную воду, затем поместите его лицевой стороной вверх на микропредметное стекло, добавив 10 µL среды для заключения. Сверху наложите покровное стекло размером 18 × 18 мм и с помощью бумажных салфеток аккуратно прижмите его к клеткам. В завершение загерметизируйте края лаком для ногтей. При имитации инъекции только плазмиды, кодирующей V-S-V-G-T-S-O 45 GFP, белок доставляется на базолатеральную поверхность хорошо поляризованных клеток MDCK, о чем свидетельствует красное поверхностное окрашивание в клетках с низкой степенью поляризации.

Часть слитого белка с GFP будет доставлена к апикальной мембране. Если контрольные образцы выглядят подобным образом, данным нельзя доверять, и эксперимент следует повторить с использованием более поляризованных клеток. Обратите внимание, что не весь экспрессированный слитый белок с GFP доставляется к базолатеральной мембране во время периода выжидания при 31 °C, о чем свидетельствует интенсивный внутриклеточный зеленый сигнал общего белка. После освоения эта методика должна занимать примерно от 10 до 12 часов после ее разработки.

Этот метод открыл исследователям в области мембранного транспорта путь к изучению регуляторных белков в поляризованных эпителиальных клетках. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как экспрессировать белки в поляризованных эпителиальных клетках с помощью метода микроинъекций.