Визуализация mtHyPer7, ратиометрического биосенсора для митохондриальной перекиси, в живых клетках дрожжей
2 июня 2023 г.
Перекись водорода (H2O2) является одновременно источником окислительного повреждения и сигнальной молекулой. Этот протокол описывает, как измерить митохондриальныйH2O2 с помощью митохондриального HyPer7 (mtHyPer7), генетически кодируемого ратиометрического биосенсора, у живых дрожжей. В нем подробно описывается, как оптимизировать условия визуализации и выполнять количественный клеточный и субклеточный анализ с помощью бесплатного программного обеспечения.
Митохондрии — это органеллы в клетках, которые способствуют мобилизации энергии, центральному метаболизму, производству жизненно важных макромолекул, накоплению кальция и передаче сигналов. В результате они играют решающую роль в клеточной функции, физической форме и контроле продолжительности жизни. Наше исследование сосредоточено на изучении влияния митохондрий на старение с использованием почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма.
Визуализация живых клеток является нашим лучшим инструментом для наблюдения за изменениями в митохондриальной функции. В этой статье мы опишем метод, в котором используется генетически закодированный биосенсор с метрическим спектральным сдвигом соотношения, называемый митохондриальным HyPer7. mtHyPer7 обнаруживает перекись водорода, активную форму кислорода, которая может повреждать клеточные компоненты, но также функционирует как сигнальная молекула в митохондриях живых клеток.
mtHyPer7 обладает высоким сродством к перекиси водорода и низкой чувствительностью к pH. Он интегрирован в геном дрожжей, что приводит к стабильной и последовательной экспрессии в популяциях дрожжевых клеток. Наконец, он количественно нацелен на митохондрии и не оказывает заметного влияния на клеточную или митохондриальную функцию или приспособленность.
Биосенсоры, такие как mtHyPer7, имеют решающее значение для изучения функции митохондрий при субклеточном разрешении, для поиска механизмов, лежащих в основе контроля качества митохондрий, и для изучения того, как этот процесс влияет на приспособленность клеток, питание и продолжительность жизни. Краситель mtHyPer7 обеспечивает стабильную работу в отличие от органических красителей, используемых для обнаружения активных форм кислорода. По сравнению с датчиками на основе FRET, mtHyPer7 более компактен и позволяет избежать таких проблем, как перекрестное возбуждение и прокачка, а также требований к точному позиционированию и ориентации для FRET.
Обзор
В данном исследовании изучается функция митохондрий у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae, при этом особое внимание уделяется роли перекиси водорода (H2O2) как повреждающего агента и сигнальной молекулы. Используя генетически кодируемый ратиометрический биосенсор mtHyPer7, исследователи описывают метод количественного измерения содержания H2O2 в митохондриях живых клеток.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Функция митохондрий
- Окислительный стресс
- Старение дрожжей
Теоретические сведения
- Митохондрии необходимы для выработки клеточной энергии и передачи сигналов.
- H2O2 может вызывать окислительное повреждение, но также участвует в сигнальных путях.
- Состояние митохондрий связано с продолжительностью жизни и здоровьем клеток.
Используемые методы
- Визуализация живых клеток с помощью биосенсора mtHyPer7
- Модельный организм: Saccharomyces cerevisiae
- Флуоресцентная микроскопия для количественного анализа
Основные результаты
- Успешная визуализация уровней митохондриального H2O2 в живых клетках дрожжей.
- Установление оптимальных условий для визуализации и анализа полученных изображений.
- Доказательство того, что mtHyPer7 не влияет на функции или жизнеспособность клеток.
Выводы
- В данном исследовании представлен надежный метод измерения митохондриального H2O2 и его влияния на здоровье клеток.
- Работа способствует пониманию механизмов контроля качества митохондрий и их воздействия на процессы старения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная визуализация митохондриального перекиси водорода в живых клетках дрожжей позволяет точно оценивать окислительно-восстановительный статус митохондрий, который является ключевым определяющим фактором состояния здоровья клеток и моделирования заболеваний. Биосенсор mtHyPer7 обеспечивает надежные и воспроизводимые показатели окислительного стресса, что способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков в процессах поиска новых лекарственных средств. Эта возможность повышает прогностическую достоверность исследований функций митохондрий, имеющих значение для изучения старения, метаболических нарушений и систем контроля качества клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямое измерение митохондриального H2O2 для выяснения окислительно-восстановительных механизмов.
- Поддерживает функциональную валидацию путей контроля качества митохондрий.
- Способствует механическому снижению рисков путем разграничения сигнальных и повреждающих окислительных событий.
- Обеспечивает стабильную, интегрированную в геном экспрессию биосенсора для последовательного биологического анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает количественные рациометрические результаты, подходящие для стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Позволяет подготавливать валидированные модели дрожжей для скрининга соединений, направленного на модуляцию митохондриального редокс-статуса.
- Обеспечивает возможность проведения высококонтентного имиджинга благодаря высокой стабильности сигнала и минимальным фоновым помехам.
- Поддерживает масштабируемый, готовый к платформе считываемый сигнал для сравнительной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставить измерения окислительно-восстановительного потенциала митохондрий с фенотипами, имеющими значение для патологии в модельных системах.
- Обеспечивает преемственность этапов от этапа открытия до доклинической валидации вмешательств, направленных на митохондрии.
- Предоставляет количественные конечные точки для принятия решений о продвижении проектов в портфелях исследований митохондрий с учетом рисков.
- Способствует разработке биомаркеров окислительного стресса и митохондриальной дисфункции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Рабочий процесс визуализации с использованием mtHyPer7 объединяет этапы от первичного поиска до разработки анализа и доклинических исследований, обеспечивая поддержку исследований на основе гипотез и преемственность трансляционных разработок.
- Открывающая биология: Количественная визуализация с помощью биосенсоров позволяет проверять гипотезы о механизмах митохондриального редокса и картировать сигнальные пути.
- Скрининг: Ратиометрические показатели и стабильная экспрессия обеспечивают воспроизводимую и масштабируемую разработку анализов для скрининга соединений.
- Аналитика: Обеспечивает надежное статистическое сравнение уровней митохондриального H2O2 при различных условиях и в разных популяциях клеток.
- Трансляционные исследования: Предоставляет количественные конечные точки, релевантные для заболеваний, для валидации доклинических моделей.
- Корпоративное повторное использование: Линии с интегрированными в геном биосенсорами и анализные скрипты с открытым исходным кодом облегчают внедрение метода в различных проектах и командах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации митохондриальных мишеней и проведении механистических исследований.
- Операционная ценность: стандартизирует процессы визуализации и анализа для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах программ исследований митохондрий.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию митохондриальных мишеней и методов вмешательства с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток и количественного анализа флуоресценции.
- Необходим доступ к конфокальному микроскопу с вращающимся диском и совместимому программному обеспечению для анализа (например, Fiji/ImageJ).
- Для обеспечения воспроизводимости результатов необходима межкомандная стандартизация параметров визуализации и скриптов анализа.
- Метод может быть адаптирован для других биосенсоров и модельных систем при оптимизации протокола.
- Для получения надежных результатов требуется стабильная интеграция генома и экспрессия.
