Создание двумерной однослойной системы культивирования первичного энтероида крупного рогатого скота для применения в трансляционных биомедицинских исследованиях
5 апреля 2024 г.
Энтероиды становятся новой моделью для изучения физиологии и патофизиологии тканей, разработки лекарств и регенеративной медицины. Здесь мы описываем 2D-систему культивирования первичных клеток крупного рогатого скота, полученную из энтероидов, которая позволяет проводить совместное культивирование с соответствующими типами клеток тканей. Эта модель предлагает трансляционное преимущество для моделирования исследований желудочно-кишечного тракта.
Наша лаборатория специализируется на изучении взаимодействий между хозяином и патогеном и динамики иммунных клеток, возникающих после инфекции. Используя надежную модель клеточной культуры, мы надеемся более точно отразить сложные взаимодействия, происходящие in vivo на тканевом уровне. В некоторой опубликованной литературе, описывающей промежуточное поколение крупного рогатого скота, отсутствуют необходимые детали для того, чтобы протокол можно было легко воспроизвести, что затрудняет его применение неопытными исследователями.
Преимущество нашей модели заключается в том, что мы предоставляем чрезвычайно подробный протокол, который может быть успешно использован начинающими исследователями. Создание монослоя Transwell позволяет проводить совместную культуру с иммунными клетками, что позволяет получить представление о тканевых патогенных взаимодействиях, сохраняя при этом организацию, подобную in vivo. Эта универсальная модель полезна для изучения многочисленных болезней крупного рогатого скота, сложность которых выходит за рамки одноклеточных моделей.
Наша лаборатория будет использовать эту модель для исследования иммунных факторов, влияющих на восприимчивость к криптоспоридийной инфекции. Это облегчит сравнение взрослого крупного рогатого скота и телят, сохранив при этом тканевую архитектуру в микроокружении иммунных клеток. Результаты этой работы имеют прямой трансляционный потенциал для здоровья человека.
Обзор
В данном исследовании представлена система 2D-культивирования энтероидов из первичных клеток крупного рогатого скота для изучения физиологии и патофизиологии тканей желудочно-кишечного тракта. Модель позволяет осуществлять совместное культивирование с соответствующими типами тканевых клеток, что расширяет возможности трансляционных исследований заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Гастроэнтерология
Теоретические основы
- Энтероиды представляют собой новую модель для изучения тканевых взаимодействий.
- В существующей литературе отсутствуют воспроизводимые протоколы для исследователей-новичков.
- Данная модель призвана более точно отражать условия in vivo.
- Она позволяет изучить сложность взаимодействий между хозяином и патогеном у крупного рогатого скота.
Цель исследования
- Разработать детальный протокол создания надежной модели клеточной культуры.
- Изучить иммунные факторы, влияющие на восприимчивость к инфекции Cryptosporidium.
- Обеспечить возможность проведения сравнительного анализа между взрослым скотом и телятами.
Используемые методы
- Создание монослоев в системе Transwell для совместного культивирования с иммунными клетками.
- Подробный пошаговый протокол культивирования и диссоциации энтероидов.
- Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER).
- Иммуноокрашивание для идентификации различных клеточных линий в энтероидах.
Основные результаты
- К 7-му дню наблюдались зрелые энтероиды с четко выраженной структурой.
- Измерения TEER указали на стабильность эпителиального барьера.
- Иммуноокрашивание подтвердило наличие энтероэндокринных клеток и клеток Панета.
- Слияние 2D-монослоев было достигнуто менее чем за одну неделю.
Выводы
- Разработанная модель представляет ценность для изучения сложных заболеваний крупного рогатого скота.
- Она позволяет получить представление о взаимодействиях между тканями и патогенами.
- Полученные результаты имеют потенциальное трансляционное значение для здоровья человека.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание системы 2D-монослоя на основе первичных энтероидов крупного рогатого скота отвечает потребности в физиологически релевантных и воспроизводимых моделях in vitro для ранних этапов открытий и трансляционных исследований. Данная платформа обеспечивает прямой доступ к просвету кишечника и поддерживает совместное культивирование с иммунными клетками, что способствует механистическому снижению рисков и повышению прогностической достоверности в исследованиях взаимодействия хозяина с патогеном и ответа на лекарственные препараты. Воспроизводимость и масштабируемость делают эту систему многократно используемым инструментом для проведения комплексных гастроинтестинальных исследований и разработки доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Позволяет исследовать взаимодействия между хозяином и патогеном в контексте, соответствующем тканевой структуре.
- Обеспечивает функциональную валидацию ответов иммунных и эпителиальных клеток.
- Способствует снижению механистических рисков за счет сохранения архитектуры, близкой к условиям in vivo.
- Предоставляет платформу для сравнительных исследований на различных стадиях развития или при различных патологических состояниях.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых монослоев, подходящих для количественного анализа.
- Позволяет проводить прямое измерение целостности барьера с помощью TEER и анализа секреции цитокинов.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и воспроизводимость результатов в разных лабораториях при оценке соединений.
- Позволяет проводить совместное культивирование с иммунными клетками для многопараметрического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, имеющим отношение к заболеванию, для трансляционного поиска биомаркеров.
- Связывает этап обнаружения и доклиническую валидацию путем моделирования сложных взаимодействий в тканях.
- Снижает трансляционный риск за счет отражения иммунного и эпителиального динамизма in vivo.
- Обеспечивает принятие обоснованных с учетом рисков решений по продвижению мишеней в желудочно-кишечном тракте.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта система 2D-монослоев охватывает все этапы от ранних открытий до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез, разработки методов анализа и проведения трансляционных исследований в области биологии желудочно-кишечного тракта.
- Фундаментальная биология: обеспечивает возможность проверки гипотез о взаимодействии эпителиальных и иммунных клеток.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные, такие как TEER и профили цитокинов.
- Аналитика: позволяет проводить прямое сравнение барьерной функции и иммунных ответов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: способствует приведению в соответствие с моделями заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное использование: предлагает стандартизированную масштабируемую платформу для различных нужд исследований желудочно-кишечного тракта.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях желудочно-кишечного тракта.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость, стандартизацию и масштабируемость между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежной валидации на ранних этапах.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению программ по изучению желудочно-кишечного тракта.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения первичных клеток и методов культивирования органоидов.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для измерения TEER и конфокальной микроскопии.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод может быть адаптирован для других видов или моделей заболеваний путем оптимизации протокола.
- Ограничения включают необходимость осторожного обращения для сохранения целостности монослоя и дифференцировки.
