Изучение актинового цитоскелета в клетках эндотелия Живая выражая GFP-актин

Целью данной процедуры является наблюдение за динамическими изменениями актинового цитоскелета в живых эндотелиальных клетках. Сначала проведите трансфекцию эндотелиальных клеток пуповины человека плазмидой A GFP beta actin и культивируйте их до достижения конфлюэнтности на покровных стеклах. Затем поместите покровные стекла в камеру для визуализации живых клеток с подогреваемым столиком и инфузией физиологического раствора с альбумином.

Заключительным этапом является сбор данных в выбранной области клеток посредством захвата серии изображений с интервалом во времени (time-lapse) до и после обработки фармакологическим агентом. Анализ графиков с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как Image J, позволяет получить данные о локальных выпячиваниях ламелль-подий, включая расстояние, время и скорость их формирования, а также перемещение актиновых волокон с течением времени. Основным преимуществом этого метода перед существующими подходами, такими как иммунофлуоресцентная визуализация, является то, что визуализация живых клеток позволяет учитывать динамическую природу актинового цитоскелета при изучении механизмов, определяющих эндотелиальную проницаемость.

Поскольку фиксированные окрашенные клетки представляют собой лишь снимки определенного момента времени и дают мало информации о динамике актина и цитоскелета до и после воздействия воспалительного медиатора, в боксе биологической безопасности стерилизуйте покровные стекла в 70% этаноле в течение двух минут, а затем высушите их на воздухе. Поместите каждое покровное стекло в 10-сантиметровую культуральную чашку и добавьте 300 µL теплого раствора желатина в центр, не касаясь краев покровного стекла. Через пять минут аспирируйте жидкость.

Теперь соберите конфлюэнтную культуру эндотелиальных клеток пупочной вены человека или VE, используя 0,25% трипсин-ЭДТА. Подсчитайте количество клеток и осадите их путем центрифугирования. Максимально удалите супернатант среды для проведения реакции трансфекции с использованием набора VE nuclear effector kit.

Ресуспендируйте клеточные осадки в базовом растворе ядерного эффектора и добавьте от 0,2 до 2 мкг плазмидного вектора GFP beta actin. Перенесите 100 µL клеточной суспензии в Q-веточника (Q-vette) для ядерного эффектора. Несколько раз аккуратно постучите по закрытому Q-vette, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха между дном Q-vette и образцом для трансфекции.

Поместите Q VET в устройство nuclear effector two и запустите программу A 0 3 4, перенеся с помощью трансфер-пипетки из набора nuclear effector kit 500 µL подогретой среды EGM two MV в qve. Затем перенесите смесь обратно в микроцентрифужную пробирку и инкубируйте в течение 15 минут. Осторожно перемешайте суспензию трансфецированных VE один раз и нанесите 300 µL суспензии на покрытую желатином покровное стекло, не касаясь краев.

Затем инкубируйте от одного до четырех часов. Осмотрите трансфицированные клетки, чтобы подтвердить их прикрепление к покровному стеклу. Затем добавьте в планшет 10 мл среды E GM two MV и продолжите инкубацию для экспрессии GFP.

Сначала добавьте среду физиологического раствора с альбумином (PSS) в систему гравитационного потока и подключите ее к встроенному нагревателю. Затем отрегулируйте регулятор потока, чтобы добиться скорости потока примерно 40 milliliters per hour. После этого остановите поток, закрыв стоп-кок с помощью аппликатора с ватным наконечником.

Нанесите вакуумную смазку на внешний край нижней стороны алмазной кюветы. Затем извлеките трансфектированную культуру из инкубатора. Осторожно поднимите покровное стекло с помощью пинцета.

Затем с помощью салфетки Kim wipe удалите излишки среды EGM two с нижней стороны предметного стекла, расположив его клетками вверх. Накройте покровное стекло алмазной кюветой для создания камеры. Быстро поместите камеру в нагреватель предметного столика.

Затяните зажимы над камерой и перенесите пипеткой примерно один миллилитр среды EGM two MV из планшета в камеру. Теперь подсоедините вакуумный шланг к его держателю с левой стороны камеры, а линию A PSS от встроенного нагревателя — к каналу с правой стороны камеры. Затем включите вакуум и откройте линию A PSS, чтобы начать перфузию ванночки над трансфицированными клетками.

Также включите встроенный нагреватель, установив температуру 37 °C. Затем поместите термометрический датчик подогреваемого столика в ванночку по краю и включите нагрев столика до 37 °C. Чтобы удалить остатки среды EGM two MV и накопившийся сорт, осторожно протрите нижнюю сторону покровного стекла салфеткой Kimwipe, смоченной в 70% этаноле, а затем сухой салфеткой Kimwipe. Оставьте трансфецированные клетки HU для уравновешивания на 30 минут.

Заблокируйте перемещение карет. Сосредоточьтесь на выбранном участке культуры клеток для исследования. Установите время экспозиции камеры в диапазоне от 0,5 до 2 секунд в зависимости от интенсивности сигнала GFP Act в клетках.

Также установите интервал и продолжительность эксперимента. Теперь, выключив свет в помещении, сделайте один снимок, чтобы оценить настройки. Запустите серию снимков с интервалом времени (таймлапс), контролируя получаемые изображения по мере необходимости.

В типичном протоколе зарегистрируйте фоновые изображения в течение 20–30 минут перед добавлением исследуемого агента, после чего продолжайте сбор изображений в течение от 0,5 до 4 часов. Наконец, как подробно описано в сопроводительном тексте, оцените расстояние, продолжительность и скорость протрузии ламеллиподий с помощью анализа графиков CH. В типичном эксперименте GFP-актин экспрессируется более чем в 50 % трансфицированных VE случайным образом.

Эти изображения, полученные с периодичностью один раз в минуту, зафиксировали GFP-актин во всей цитоплазме, а также в филаментозных структурах и локальных ламеллиподиях, выступающих вдоль края клетки. Дистанционная устойчивость и скорость клеточных выростов количественно определяются на основе наборов изображений тайм-лапс съемки. С помощью анализа kym-графов сначала проводится линия шириной в один пиксель примерно перпендикулярно краю клетки.

Данная область извлекается из каждого изображения набора тайм-лапс снимков для создания монтажа этой области во времени или хроно-графика (chime graph). Здесь, при рассмотрении хроно-графика слева направо, выступы представлены в виде движений вверх края клетки. Когда на край одного из таких выступов накладывается линия, можно собрать данные о пикселях, связанных с этой линией, для количественной оценки динамики выступов. Общее количество выступов на хроно-графике может быть использовано для оценки частоты появления выступов.

В данном анализе показано движение стрессовых волокон, которые формируются у периферии клетки и перемещаются к ее центру, где в конечном итоге распадаются. На kymograph стрессовые волокна выглядят как непрерывные линии в цитоплазматической области, часто смещающиеся вниз и вправо по направлению к центру клетки; в случаях, когда волокна трудно различить на исходном kymograph, фильтр «Нерезкий маскаж» (unsharp mask) повышает резкость изображения. Линии, проведенные вдоль стрессовых волокон, облегчают сбор пиксельных данных с помощью функции измерения. В качестве альтернативы линии, проведенные от начала до конца идентифицированного стрессового волокна, позволяют получить усредненные данные по пикселям за весь период наблюдения за этим волокном.

В данной презентации было продемонстрировано, как анализировать данные набора изображений, полученных методом таймлапс-съемки, с помощью анализа графиков в таких программах, как Image J. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как изучать динамику актинового цитоскелета в ответ на воспалительные медиаторы, используя прижизненную визуализацию трансфектированных эндотелиальных клеток.