Очистка и характеристика внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека
3 мая 2024 г.
Этот протокол описывает все процедуры, от культивирования мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) человека, полученных из жировой ткани, и сбора надосадочной жидкости до экстракции внеклеточных везикул (ВВ) с помощью ультрацентрифугирования.
Наши исследования сосредоточены на получении и очистке внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток человека, полученных из жировой ткани. Проблема, которую мы хотим решить, заключается в том, как стандартизировать этот процесс и повысить эффективность очистки. В настоящее время существует множество технологий, используемых для извлечения внеклеточных везикул, таких как ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, объемная эксклюзионная хроматография, осаждение полимеров, захват иммуноаффинности, микрофлюидные технологии и так далее.
Тем не менее, ультрацентрифугирование признано золотым стандартом, по общему признанию. В будущем мы сосредоточимся на применении внеклеточных везикул в качестве векторов, в том числе на переносе мРНК, плазмид и других малых молекул и их трансфекции в клетки.
Обзор
В данном протоколе описывается процесс подготовки и очистки внеклеточных везикул (ВКВ), полученных из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека (МСКЖ). Основное внимание уделяется стандартизации процесса экстракции для повышения эффективности очистки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования стволовых клеток
Теоретические основы
- Внеклеточные везикулы играют важнейшую роль в межклеточной коммуникации.
- МСК жировой ткани (ADSCs) являются перспективным источником для выделения внеклеточных везикул.
- Существуют различные технологии выделения внеклеточных везикул, при этом ультрацентрифугирование считается «золотым стандартом».
- Повышение эффективности очистки необходимо для дальнейшего применения данных методов.
Цель исследования
- Стандартизировать процесс выделения EV из ADSC.
- Повысить эффективность очистки EV.
- Изучить применение EV в качестве векторов для мРНК и плазмид.
Используемые методы
- Культивирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека.
- Сбор супернатанта из культур клеток.
- Выделение внеклеточных везикул методом ультрацентрифугирования.
- Оценка эффективности очистки.
Основные результаты
- Были разработаны стандартизированные протоколы экстракции EV.
- Ультрацентрифугирование оказалось эффективным методом очистки EV.
- Были определены возможности дальнейшего применения EV, включая доставку генов.
- Обсуждались потенциальные способы повышения эффективности очистки.
Выводы
- В исследовании представлена методика извлечения внеклеточных везикул (EV) из МСКЖ.
- Стандартизация является ключевым фактором совершенствования процессов очистки.
- Внеклеточные везикулы являются перспективными для терапевтического применения в доставке генов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Стандартизированная очистка и характеристика внеклеточных везикул (ВКВ), полученных из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека (МСК-ЖТ), отвечают критической потребности в воспроизводимых и высококачественных препаратах ВКВ на ранних этапах биофармацевтических исследований и разработок.&D. Надежное выделение внеклеточных везикул (ВВ) является основой для изучения механизмов, валидации мишеней и разработки систем доставки на базе ВВ. Данный рабочий процесс обеспечивает прогностическую достоверность и трансляционную преемственность для применения в регенеративной медицине и генной терапии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках&D
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы паракринной сигнализации, имеющие значение для регенерации тканей.
- Обеспечивает функциональную валидацию путей межклеточной коммуникации, опосредованной внеклеточными везикулами (EV).
- Способствует снижению биологических рисков за счет предоставления стандартизированных препаратов EV для проверки гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение воспроизводимых образцов EV для последующих количественных анализов и исследования биомаркеров.
- Способствует стандартизации анализа за счет минимизации вариабельности между партиями при выделении EV.
- Позволяет надежно оценивать содержимое и функциональные свойства EV в скрининговых платформах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает получение релевантных заболеванию внеклеточных везикул (EV) для доклинических исследований в области регенеративной медицины.
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров за счет обеспечения единообразной характеристики EV.
- Поддерживает движение по этапам разработки терапевтических векторов на основе EV с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол очистки внеклеточных везикул (EV) интегрируется в непрерывный процесс от фундаментальных открытий до доклинических исследований, поддерживая как изучение механизмов, так и трансляционные исследования систем доставки на основе EV.
- Открывающая биология: Стандартизированное выделение внеклеточных везикул обеспечивает надежную проверку гипотез о паракринных и регенеративных механизмах.
- Скрининг: Количественная характеристика внеклеточных везикул (размер, морфология, экспрессия маркеров) подтверждает готовность анализа и его воспроизводимость.
- Аналитика: Результаты анализа методом отслеживания наночастиц и вестерн-блоттинга позволяют получить количественные и качественные показатели внеклеточных везикул для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Стабильное получение препаратов внеклеточных везикул способствует доклинической оценке методов регенеративной медицины и доставки генов.
- Корпоративное повторное использование: Данный протокол описывает создание универсальной платформы для выделения внеклеточных везикул (ВКВ) из различных образцов.&D-программы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов относительно механизмов, опосредованных EV, и валидации мишеней.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию рабочих процессов выделения EV.
- Стратегическая ценность: способствует принятию обоснованных решений о целесообразности дальнейшей разработки терапевтических средств на основе EV.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию активов и трансляционных проектов, связанных с EV, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, ультрацентрифугированием и методами анализа EV (ПЭМ, анализ траекторий наночастиц, вестерн-блоттинг).
- Необходим доступ к высокоскоростным ультрацентрифугам и аналитическому оборудованию.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости препаратов EV.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов клеток или подтипов EV.
- Ограничения включают возможную агрегацию EV и низкий процент выхода, характерный для ультрацентрифугирования.
