Диагностика на основе CRISPR в месте оказания медицинской помощи с использованием предварительно смешанных и лиофилизированных реагентов
16 августа 2024 г.
Здесь мы представляем пошаговое приготовление предварительно смешанных, лиофилизированных рекомбиназ на основе изотермической амплификации и кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR), которые могут быть использованы для обнаружения биомаркеров нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний или других генетических маркеров, представляющих интерес.
Мы разрабатываем тесты на месте оказания медицинской помощи для выявления этих материалов инфекционных заболеваний. В этом тесте используется изотермическая амплификация нуклеиновых кислот и детектирование на основе CRISPR. Обладая высокой осмотической точностью, аналогичной ПЦР, они могут обнаруживать небольшие различия в последовательностях, включая однонуклеотидный полиморфизм, и могут быть множественными.
CRISPR, осмотические реакции содержат множество компонентов и этапов, и их трудно выполнить в месте оказания медицинской помощи. Поскольку осмотики основаны на CRISPR, они очень чувствительны, существует риск переноса загрязнения, что может привести к ложным результатам. К счастью, эту проблему можно смягчить, если мы упростим процедуры реакций.
Мы предлагаем простой в использовании метод выявления возбудителей наших болезней и генетических маркеров с помощью изотермической амплификации рекомбиназы и реагентов на основе CRISPR. Эти реагенты просты в хранении и использовании. Мы также предлагаем советы по устранению распространенных проблем при использовании этих методов и реагентов, чтобы облегчить людям их использование.
В протоколе здесь используются реагенты CRISPR, которые облегчают транспортировку и хранение. Сублимированные реагенты могут быть легко регидратированы в местах использования и сохраняют высокую эффективность амплификации и обнаружения. Мы надеемся применять диагностические технологии CRISPR для выявления эндемических и новых инфекционных заболеваний.
Если этот тест может быть регулярно и правильно выполнен в месте оказания медицинской помощи, это может помочь в выборе противовирусных препаратов и антибиотиков, потенциально спасти жизни, снизить чрезмерное использование лекарств и развитие резистентности.
Обзор
В данной статье представлен метод разработки экспресс-тестов, в которых используются изотермическая амплификация нуклеиновых кислот и детекция на основе CRISPR для идентификации генетического материала возбудителей инфекционных заболеваний. Этот подход направлен на повышение чувствительности и точности при одновременном решении таких проблем, как риск контаминации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Диагностика инфекционных заболеваний
- Методы амплификации нуклеиновых кислот
- Технология CRISPR
Теоретические сведения
- Тестирование по месту оказания медицинской помощи имеет решающее значение для быстрой диагностики инфекционных заболеваний.
- Изотермическая амплификация позволяет эффективно обнаруживать нуклеиновые кислоты.
- Технология CRISPR обеспечивает высокую чувствительность при идентификации генетического материала.
- Риски контаминации могут привести к ложным результатам в высокочувствительных анализах.
Цель исследования
- Разработка упрощенной процедуры для реакций на основе CRISPR.
- Повышение точности обнаружения малых генетических вариаций.
- Снижение рисков контаминации в условиях диагностики по месту оказания медицинской помощи.
Используемые методы
- Приготовление предварительно смешанных лиофилизированных реагентов для изотермической амплификации.
- Внедрение методов детекции на основе системы CRISPR.
- Оценка чувствительности и специфичности при обнаружении биомаркеров нуклеиновых кислот.
- Оптимизация условий реакции для снижения риска контаминации.
Основные результаты
- Разработанный метод продемонстрировал высокую чувствительность при обнаружении генетических маркеров.
- Риски контаминации были значительно снижены за счет упрощения процедуры.
- Результаты были сопоставимы с традиционными методами ПЦР.
- Данный подход подходит для применения в диагностике по месту оказания медицинской помощи.
Выводы
- В данном исследовании представлен эффективный метод быстрого обнаружения патогенов инфекционных заболеваний.
- Анализы на основе CRISPR могут быть эффективно упрощены для практического применения.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на дальнейшем повышении надежности тестов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Предварительно смешанные и лиофилизированные диагностические реагенты на основе CRISPR обеспечивают быстрое и точное обнаружение генетических маркеров инфекционных заболеваний непосредственно в месте оказания медицинской помощи, устраняя операционные трудности при децентрализованном тестировании. Такой подход снижает сложность ручных манипуляций и риск контаминации, что способствует масштабируемому внедрению метода в условиях ограниченных ресурсов и в полевых условиях. Данный метод повышает достоверность прогнозов для раннего вмешательства и позволяет принимать терапевтические решения в режиме реального времени.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Обеспечивает быстрый анализ генетических маркеров патогенов для валидации мишеней в исследованиях инфекционных заболеваний.
- Способствует снижению биологических рисков за счет высокочувствительного обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов.
- Облегчает сортировку портфеля препаратов путем дифференциации близкородственных штаммов патогенов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает поставку готовых к использованию валидированных систем реагентов для оптимизации рабочих процессов разработки анализа.
- Повышает воспроизводимость и стандартизацию анализа благодаря использованию предварительно смешанных лиофилизированных форм.
- Обеспечивает возможность масштабируемого скрининга клинических или экологических образцов при минимальном наборе оборудования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров, обеспечивая возможность обнаружения значимых для заболевания сигнатур нуклеиновых кислот.
- Обеспечивает преемственность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет предоставления надежных диагностических средств, пригодных для использования в полевых условиях.
- Снижает риски при продвижении диагностических кандидатов, демонстрируя стабильность и эффективность реагентов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод охватывает весь цикл от раннего этапа поиска до трансляционных исследований, обеспечивая рабочие процессы от идентификации мишени до доклинической валидации диагностических платформ.
- Биология открытий: обеспечивает высокоточное обнаружение генетических мишеней для проверки гипотез и изучения механизмов.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные количественные результаты для сравнения условий образцов и эффективности анализа.
- Аналитика: позволяет получать высокочувствительные данные флуоресценции для надежного анализа данных и принятия решений.
- Трансляционные исследования: связывают лабораторные и прикладные исследования, поддерживая разработку диагностики на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает платформу многоразовых реагентов, адаптируемую к различным патогенным мишеням и типам образцов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность при обнаружении патогенов.
- Операционная ценность: упрощает рабочие процессы, повышает воспроизводимость и обеспечивает возможность логистики без соблюдения холодовой цепи.
- Стратегическая ценность: ускоряет принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки диагностических кандидатов и снижает риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию диагностических активов для новых и эндемических заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области амплификации нуклеиновых кислот и разработки анализов на основе CRISPR.
- Для полноценного выполнения рабочего процесса необходим доступ к оборудованию для лиофилизации и флуоресцентным планшетным ридерам.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов приготовления реагентов и обращения с ними.
- Метод адаптируем к различным типам образцов, но может потребовать оптимизации для конкретных патогенов.
- Стабильность и эффективность подтверждены в течение как минимум восьми месяцев при -20°C, что позволяет использовать метод при длительном развертывании.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
